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虫草素对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38mapk通路及tgf―β1表达的影响

虫草素对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38mapk通路及tgf―β1表达的影响

[摘要]目的 探讨虫草素(cordycepin)对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38mapk通路及tgf-β1表达的影响。方法 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株(nrk52e细胞株),分为正常对照组(ng组)、高糖组(hg组)、高糖+虫草素组(hg+c组)。应用定量rt-pcr测定nrk52e p38mapk及tgf-β1 mrna的表达;采用western印迹方法检测不同时间点p-p38mapk、tgf-β1蛋白的表达水平。结果 与ng组比较,hg组nrk52e细胞的p38mapk、tgf-β1 mrna表达增多(p 1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 用低糖deme完全培养基(含10%胎牛血清)培养细胞,待细胞贴壁60%~80%,改用无血清培养基进行同步培养,将细胞按照设计进行分组并加入不同浓度葡萄糖:正常对照组(5.5 mmol/l)、高糖组(30 mmol/l)、高糖+虫草素组(30 mmol/l,虫草素浓度10 μg/ml),高糖+虫草素组使用虫草素进行预先干预2 h。

1.2.2 qrt-pcr 待细胞培养足够时间,收集细胞,提取细胞的总rna。然后对rna进行od值及浓度测定。取1 μg的总rna按照试剂盒说明书的方法进行合成cdna,然后再对逆转录产物进行扩增。采用primer 5.0软件设计目的基因引物序列,由北京华大基因公司合成,所得引物用depc水稀释后放于-20℃备用,各基因引物序列见表1。反应体系:sybr 10 μl;forward 0.16 μl;reverse 0.16 μl;ddh2o 4.68 μl;cdna 5 μl;反应条件及步骤:①预变性:采取95℃进行2 min;②变性:95℃的温度进行15 s;③退火:58℃进行30 s;④延伸:72℃延伸30 s;⑤循环:总共经过40个循环,再充分延伸10 min。将所合成的指标(p38mapk、tgf-β1)与内参(gapdh)的ct值采取取对数的方式进行比较,其比值表示待测指标的mrna的相对表达量。

1.2.3 western blot 按设计分组培养细胞并加入不同的刺激,15 min、30 min、60 min、12 h、24 h、48 h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,进行超声破碎,接着采用bca定量法对蛋白进行测定其浓度。采用8% sds-page分离胶上样,电泳时先采用80 v,待样品蛋白到达分离胶后,改成120 v,继之在340 ma下转膜2.5~3 h,使用5%脱脂牛奶封闭2 h,一抗采用浓度为:(p-p38mapk,1∶3000;tgf-β1,1∶2000)过夜,使用脱脂牛奶洗涤加二抗(1∶5000~1∶10 000),暗室曝光、显影,最后进行灰度分析。

1.3统计学方法

采用spss 17.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用lsd-t检验;以p [⒖嘉南]

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