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虫草素调控eif2α/tgf―β/smad信号通路改善肾间质纤维化的机制

虫草素调控eif2α/tgf―β/smad信号通路改善肾间质纤维化的机制

[摘要] 目的:观察冬虫夏草主要有效成分――虫草素(cordycepin)对肾间质纤维化及其eif2α/tgf-β/smad信号通路的干预作用和机制。方法:将15只c57bl/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组,建立小鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,uuo)肾间质纤维化模型,虫草素组小鼠经皮下注射虫草素(5 mg・kg-1・d-1),同时,以生理盐水干预对照组和模型组,共5 d。实验结束后,取小鼠结扎侧的肾脏,观察肾间质纤维化病理特征,并测定肾组织i型胶原(collagen type i,col i)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-sma)核酸表达(northern blot);另外,在体外培养大鼠肾小管上皮细胞(nrk-52e细胞),在转化生长因子(transforming growth factor,tgf)- β联合或不联合虫草素干预后,观察i型胶原、iv型胶原(collagen type iv,col iv)核酸表达的变化(northern blot),并检测eif2α、磷酸化eif2α(phosphorylated eif2α,p-eif2α)以及smad2/3、磷酸化smad2/3(phosphorylated smad2/3,p-smad2/3)蛋白表达的变化(western blot)。结果:虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化,包括纤维化的病理特征以及i型胶原、α-sma核酸的表达;虫草素在体外促进nrk-52e细胞p-eif2α的高表达,抑制tgf-β诱导的p-smad2/3以及i型、iv型胶原的表达水平。结论:虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用,它可能是通过诱导eif2α磷酸化,抑制tgf-β/smad信号通路中的关键信号分子――p-smad2/3表达,减少肾组织胶原和α-sma表达等途径而改善肾间质纤维化。

[关键词] 虫草素;肾间质纤维化;eif2α/tgf-β/smad信号通路

肾间质纤维化是各类慢性肾脏病(chronic kidney disease,ckd)发展至终末期肾病的基本环节[1]。目前,冬虫夏草(cordyceps militaris)及其制剂在临床上被广泛应用于治疗各种ckd,而且,对肾脏纤维化有一定的改善作用[2]。研究表明,冬虫夏草制剂可以拮抗5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的进展[3],还可以减少糖尿病大鼠肾组织转化生长因子(transforming growth factor,tgf)-β的产生以及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-sma)、iv型胶原(collagen type iv,col iv)的表达[4-5]。虫草素(cordycepin)是冬虫夏草的主要有效成分[6],具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、抗衰老等多种功效[7-8]。据报道[9],虫草素可抑制tgf-β信号及其诱导的α-sma和纤维连接蛋白(fibronectin,fn)合成。然而,虫草素保护肾损伤的深层作用机制尚未完全阐明。

真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor,eif)2α在真核生物核酸翻译起始过程中介导起始转移核糖核酸(trasfer rna,trna)与核糖体的结合,它是核酸翻译的关键调控因子之一。激活eif2α可抑制eif2β亚单位活性,影响eif2-gtp形成,进而引起核酸翻译受阻[10]。据报道,在水貂的肺上皮细胞(mv1lu细胞)中,过度表达的eif2α可以直接抑制tgf-β的应答,干扰其下游相关信号蛋白的合成与表达[11];笔者既往研究[12]表明,虫草素可促进eif2α磷酸化。因此,笔者推测,虫草素可能通过活化eif2α信号,引起翻译抑制,发挥调控smad信号通路活性的作用。在本课题中,笔者首先在体内观察虫草素对小鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction,uuo)肾间质纤维化模型的干预作用;其次,通过体外实验,观察虫草素对肾小管上皮细胞eif2α磷酸化及tgf-β/smad信号通路的影响,最终,揭示其改善肾间质纤维化的可能机制。

1 材料

1.1 动物 体重约20 g的c57bl/6雄性小鼠(spf)购自并饲养于日本山梨大学(university of yamanashi)动物实验中心。所有小鼠均给予标准饮食,并自由饮水。小鼠适应性饲养1周后开始正式实验。

1.2 药物与试剂 虫草素购自sigma-aldrich公司,重组tgf-β购自r&d system公司。抗总eif2α抗体购自santa cruz biotechnology,抗磷酸化eif2α(phosphorylated eif2α,p-eif2α)抗体、抗α-sma抗体、抗磷酸化smad2/3(phosphorylated smad2/3,p-smad2/3)抗体、抗smad2/3抗体、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)标记的相应二抗均购自于cell signaling公司。总rna提取试剂盒购自promega公司。

2 方法

2.1 肾间质纤维化模型制作 参照chevalier的方法[13]进行uuo手术。小鼠经麻醉后分离左侧输尿管,以0号丝线在2处不同部位完全结扎;对照组仅接受麻醉、打开腹腔并分离左侧输尿管,但不进行结扎操作。 2.2 动物分组及给药 将15只小鼠随机分为3组,即对照组、模型组和虫草素组。自建立uuo模型当日开始,虫草素组小鼠经腹腔注射给予虫草素(5 mg・kg-1・d-1),对照组和模型组小鼠仅给予同体积的生理盐水,每日1次。在手术后第5天处死小鼠,并分离左侧肾脏,用于组织学染色、免疫组织化学染色(简称“免疫组化”)以及核酸、蛋白质分析。

2.3 细胞培养及干预措施 体外培养实验采用大鼠肾小管上皮细胞(nrk-52e细胞)进行(购自日本atcc细胞库)。使用dmem/f-12培养液(hyclone公司)+5% fbs(sciencell公司)+1×105 u・l-1的青、链霉素(hyclone公司);在37 ℃,5%co2培养箱中进行培养。每天观察细胞数量及形态,待细胞生长汇合至80%时,用0.25%的胰蛋白酶(hyclone公司)消化5 min,至贴壁细胞漂浮后,予5 ml含5%fbs的完全培养基终止消化,轻轻吹打,制成单细胞悬液,于低速离心机中1 000 r・min-1离心4 min,吸引器吸出上清液,往分离出来的细胞团块中加入适量培养基,吹打混匀。取处于对数生长期的细胞进行实验。体外实验中加入虫草素(0.5,1,5 mg・l-1),联合或不联合tgf-β(5 μg・l-1)进行干预。

2.4 蛋白质分析 采用western blot进行蛋白质分析。将分离的肾皮质加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,pmsf)的总蛋白裂解液中,在电动匀浆机匀浆后,离心,取上清液。提取总蛋白后,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,bca)法测定蛋白浓度。配制分离胶和积层胶。将各样本20 μl与等量的蛋白上样缓冲液混匀,在沸水中煮5 min,各取30 μl分别加样,在电泳槽中加满电泳缓冲液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,sds-page)凝胶电泳。电泳完毕后,取下凝胶,电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,pvdf)膜,用含5%脱脂奶粉和tbst缓冲液(20 mmol・ l-1 trishcl,150 mmol・l-1 nacl,0.05% tween 20)封闭2 h。加入相关待测定蛋白抗体,摇晃过夜。洗涤pvdf膜,加入相应的二抗(1∶1 000),室温孵育1 h。取出pvdf膜,置于显色液(dab显色试剂盒)中显色,定影。用quantity one 4.1.1软件(bio-rad)进行吸光度分析,结果分别与β-actin或eif2α吸光度对照,其比值表示蛋白相对表达量。

2.5 核酸分析 采用northern blot进行核酸分析。根据总rna提取试剂盒说明书的步骤进行,在细胞或组织中加1 ml trizol reagent,反复均匀吹打,室温下放置5 min,吸取上清液置入eppend阳光虫草阳光虫草

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orf管,再加入氯仿0.2 ml,低温条件下12 000 r・min-1离心15 min,取上清液,加入异丙醇0.5 ml,再次低温12 000 r・min-1离心15 min,弃上清液,用75%乙醇洗涤沉淀物,用depc处理水溶解沉淀的rna;取2 μl样本,分别用波长260,280 nm的紫外分光光度仪测定a,比值约等于2。采用甲醛变性凝胶电泳法分离rna。northern杂交采用含甲酰胺的杂交体系,42 ℃预杂交2~4 h后,加入标记的探针,然后42 ℃杂交过夜。洗膜后,使用typhoon激光分子成像系统进行观察并成像。cdna探针包括iv型胶原[14]、i型胶原[15]及α-sma[16](日本山梨大学miyazawa教授惠赠)。用quantity one 4.1.1软件(bio-rad)进行光密度分析,结果分别与gapdh光密度对照,其比值表示核酸相对表达量。

2.6 肾脏病理分析 肾脏摘除后分离并取少量肾上极皮质,固定于10%中性甲醛内,经脱水、透化后,石蜡包埋,切片厚度3 μm,常规进行masson染色;光学显微镜下观察肾间质纤维化的组织特征。

2.7 免疫组化分析 采用免疫组化观察肾组织α-sma表达。将肾组织石蜡切片(4 μm),常规脱蜡,水化,用含3%的h2o2封闭内源性过氧化物酶。在37 ℃环境中用胰蛋白酶(1 g・l-1)修复抗原30 min。加入一抗[单克隆抗体α-sma(1∶100)],4 ℃冰箱过夜。磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,pbs)洗涤后加相应二抗[羊抗鼠igg(1∶200)],孵育20 min,二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)显色剂显色。用ddh2o终止显色,苏木素复染1~2 min,兰化,常规脱水、透明、封片。

2.8 统计学分析 采用spss 17.0统计软件进行分析,计量资料以±s表示,多组间均数比较采用非参数mann-whitney u检验,p-1)预处理nrk-52e细胞,诱导其i型和iv型胶原核酸表达水平上升;在此基础上,当加入不同浓度(0,0.5,1,5 mg・l-1)虫草素干预后,northern blot结果显示,i型和iv型胶原核酸表达水平均逐渐降低;与前一个干预浓度相比,在5 mg・l-1与1 mg・l-1之间,其差异有统计学意义(p-1)预处理nrk-52e细胞。western blot结果显示,tgf-β诱导p-smad2/3蛋白表达水平上调;当加入虫草素(5 mg・l-1)干预后,p-smad2/3蛋白表达水平下调;与未加虫草素时相比,其差异有统计学意义(p[17-18]。tgf-β主要依靠smad信号通路来介导其

与对照组相比1)p[19]。在本课题中,笔者借助体外培养的肾小管上皮细胞(nrk-52e细胞),先以tgf-β处理,观察其p-smad蛋白的表达水平。结果显示,tgf-β可诱导smad2/3磷酸化,p-smad2/3高表达,而一定浓度的虫草素不仅能够有效地抑制smad2/3蛋白的磷酸化,同时,亦减少了其下游的i型和iv型胶原蛋白的表达。li等[9]报道,虫草素可抑制tgf-β1诱导的大鼠肾脏成纤维细胞(nrk-49f细胞)smad2/3核内转移和积聚,并减少下游的α-sma及纤维连接蛋白合成。笔者的研究进一步证实,虫草素的抗纤维化作用的确与tgf-β/smad信号通路有关,然而,虫草素的主要靶点是smad磷酸化水平,而对其总蛋白水平并无明显的影响,也就是说,虫草素对tgf-β/smad信号的抑制作用并非是干预smad蛋白合成,而是降低其磷酸化水平。笔者认为,这可能是虫草素改善肾间质纤维化的机制之一。 然而,有意思的是,越来越多的证据表明虫草素并不是直接作用于smad信号途径的。笔者发现,对于体外培养的nrk-52e细胞,虫草素首先促进的是eif2α磷酸化水平。eif2α介导真核生物翻译的起始过程,磷酸化的eif2α可引起翻译受阻[10]。mcgonigle等[11]发现,磷酸化的eif2α可以与tgf-β受体相结合,并干扰其下游信号转导,同时,eif2α过表达还可以直接抑制tgf-β的合成和释放。这一结果提示,eif2α在上游调控tgf-β及其信号通路;虫草素促进eif2α磷酸化而直接与tgf-β受体结合,再影响其下游信号。这可能与其经典的翻译抑制作用无关。因此,虫草素抗肾脏纤维化的作用可能还有另外的分子靶点,也就是eif2α/tgf-β/smad信号通路。

总之,借助uuo模型和nrk-52e细胞模型,笔者阐明,虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用,它可能是通过诱导eif2α磷酸化,抑制tgf-β/smad信号通路中的关键信号分子――p-smad2/3表达,减少肾组织胶原和α-sma表达等途径而改善肾间质纤维化。

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[19] derynck r,zhang y e. smad-depend阳光虫草阳光虫草

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ent pathways in tgf-beta family signalling [j]. nature,2003,425(6958):577.

mechanisms of cordycepin on improving renal interstitial fibrosis via

regulating eif2α/tgf-β/smad signaling pathway

gu liu-bao1,2, bian rong-wen1*, tu yue3, hu hao3, wan yi-gang4, sun wei3

(1. department of end阳光虫草阳光虫草

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ocrinology, jiangsu province official hospital, nanjing 210024, china;

2. department of molecular signaling, university of yamanashi, yamanashi 409-3898, japan;

3. research institute of kidney disease, nanjing university of chinese medicine, nanjing 210029, china;

4. nanjing drum tower hospital, the affiliated hospital of nanjing university medical school, nanjing 210008, china)

[abstract] objective: to investigate the effects and mechanisms of cordycepin,an effective component of cordyceps militaris,on renal interstitial fibrosis(rif)and its related eif2α/tgf-β/smad signaling pathway. method: firstly,15 c57bl/6 mice were randomly divided into 3 groups,the control group(group a),the model group(group b)and the cordycepin-treated group(group c). after renal interstitial fibrotic model was successfully established by unilateral ureteral obstruction(uuo),the mice in group c were intraperitoneally administrated with cordycepin(5 mg・kg-1・d-1)and the ones in group a and b were administrated with physiological saline for 5 days. at the end阳光虫草阳光虫草

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of the study,the obstructed kidneys were collected and detected for the pathological changes of rif,and the mrna expressions of collagen type i(col i)and α-smooth muscle actin(α-sma)in the kidney by northern blot. secondly,after renal tubular epithelial(nrk-52e)cells cultured in vitro were exposed to transforming growth factor(tgf)-β with or without cordycepin,the mrna expressions of col i and collagen type iv(col iv)by northern blot,and the protein expressions of eukaryotic initiation factor 2α(eif2α),phosphorylated eif2α(p-eif2α),smad2/3 and phosphorylated smad2/3(p-smad2/3)were tested by western blot. result: in vivo,cordycepin alleviated rif in model mice,including improving fibrotic pathological characteristics and mrna expressions of col i and α-sma. in vitro,cordycepin induced the high expression of p-eif2α,and inhibited the expressions of p-smad2/3,col i and col iv induced by tgf-β in nrk-52e cells. conclusion: cordycepin attenuates rif in vivo and in vitro,probably by inducing the phosphorylation of eif2α,suppressing the expression of p-smad2/3,a key signaling molecule in tgf-β/smad signaling pathway,and reducing the expressions of collagens and α-sma in the kidney.

[key words] cordycepin; renal interstitial fibrosis; eif2α/tgf-β/smad signaling pathway

doi:10.4268/cjcmm20142104

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