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虫草素与羟丙基β环糊精的包合行为及性能研究

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:1 热度: 39,055 ℃

阳光虫草

虫草素与羟丙基β环糊精的包合行为及性能研究

虫草素与羟丙基β环糊精的包合行为及性能研究

摘 要 通过饱和溶液方法制备了虫草素(cor)与羟丙基β环糊精(hpβcd)形成的包合物。采用紫外可见光谱法对水溶液中hpβcd与虫草素(cor)的包合行为进行研究,利用job曲线法确定cor/hpβcd包合物的包合比,通过1h nmr和2d nmr、dsc、tg、xrd 、ftir和sem对cor/hpβcd包合物进行表征和性能测定。结果表明,cor/hp βcd包合物的包合比为1∶1,虫草素与hpβcd形成包合物后,其水溶性、热稳定性及生物环境稳定性都得到明显提高。cor/hpβcd包合物在医药领域具有潜在的应用前景。

1 引 言

虫草素(cordycepin,cor,c10h13n5o3,结构如图1),又称虫草菌素、3脱氧腺苷,属于嘌呤类生物碱,是我国传统中药冬虫夏草的有效成分。虫草素最初从野生真菌中分离出来,是第一种天然核苷类抗菌素[1,2]。研究表明,虫草素具有抗肿瘤、抗真菌、抑制微生物生长、抗炎、降血糖、抗动脉粥样硬化等多种药用功效[3~6]。特别是对于白血病的治疗[7,8],具有良好的临床应用前景。但是野生冬虫夏草的资源有限[9],并且其药用有效成分虫草素的含量低,水溶性和生物利用度也低[9~11],在体内不稳定、容易降解而失去活性[12],导致其在药物制剂方面的应用受到限制[13]。目前,主要通过结构修饰[14~16],或者与腺苷脱氨酶抑制剂联合应用[17,18]来改善虫草素的稳定性。但这些方法存在着制备困难[14]、选择性抑制大部分病毒[16]以及容易产生副作用[17]等问题。因此,研究有效的药物辅料以提高虫草素的稳定性、水溶性和生物利用度具有重要意义。

图1 虫草素(cor)的结构

fig.1 structure of cordycepin (cor)

环糊精(cyclodextrin,cd)及其衍生物作为一种优良的脂溶性药物载体,一直以来都是研究热点。其中衍生物羟丙基β环糊精(hydroxypropylβcyclodextrin,hpβcd)在药物、食品、化妆品等各个领域均被广泛的应用[1922]。主要是因为hpβcd的空腔大小适中,水溶性较好,在人体内的毒副作用小,原料便宜易得,且对提高药物溶解度及生物利用度有着显著的效果[19,23~25]。

在前期研究中,本课题组已成功应用环糊精的包合技术来改善黄酮类(橙皮素和山姜素)、木脂素类(鬼臼毒素)等天然药物分子的溶解度和稳定性[26~28]。结果表明,这些天然药物分子与hpβcd进行包合后,溶解度和稳定性得到明显改善。橙皮素、山姜素和鬼臼毒素的溶解度分别提高了411、15和28倍,其中鬼臼毒素本身的细胞毒活性在包合后没有受到影响。本实验对环糊精与虫草素的包合物进行了研究。虽然zhang等[29]报道了αcd、βcd和γcd 3种环糊精与虫草素的包合研究,但hpβcd与虫草素的包合研究未见报道。本研究将着重探讨hpβcd与虫草素形成包合物的包合模式、包合物的表征及溶解效,提供一种制备高溶解度和低毒的药物分子的新途径。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

aglient 8453紫外可见分光光度计(美国aglient公司);sta449f3热重分析仪(德国耐驰公司);bruker avance drx500核磁共振仪(瑞士bruker 公司);转靶x射线衍射仪(日本理学公司ttr 18 kw铜靶);nicolet is10 红外光谱仪(美国thermo科技有限公司)。

cor(纯度>98%,宝鸡市晨光生物科技有限公司);hpβcd(fw=1460.00,百灵威科技有限公司)。其它试剂均为分析纯,实验用水为超纯水。

2.2 cor/hpβcd包合物和物理混合物的制备

按摩尔比1∶1准确称取cor 5.0 mg,hpβcd 29.2 mg于50 ml圆底烧瓶,加入10 ml乙醇水混合液(1∶4,v/v),室温下避光搅拌14天,过滤除去不溶杂质,滤液再用0.45 μm微孔膜过滤,于50℃下减压蒸馏、真空干燥,即得白色固体包合物。

物理混合物则按摩尔比1∶1称取cor和hpβcd,使其充分混合即得。

2.3 job曲线测定

cor/hpβcd包合物的化学计量比可以通过job法[30]确定。采用ph=3.0的na2hpo4柠檬酸缓冲液配制系列浓度的cor与hpβcd混合液,保持cor和hpβcd的总浓度为4.5×10mol/l,其中cor与hpβcd的摩尔比在0~1内变化[31,32]。 在其最大吸收波长258 nm处测定吸光度。

2.4 cor的标准曲线

用无水乙醇分别配制浓度为0.021、0.023、0.025、0.027、0.029、0.031、0.033和0.035 mol/l的cor溶液并测定其吸光度。然后在origin 8.5软件中,以cor溶液的浓度c(mmol/l)为横坐标,吸光度a为纵坐标作图。标准曲线方程为a=25.80671c-0.14713,r2=0.99943(n=8)。

2.5 cor/hpβcd包合物的水溶性实验

通过制备饱和溶液的方法[33]测定cor/hpβcd包合物在水溶液中的溶解度。将过量的cor/hpβcd包合物投入2 ml水中(ph≈7.0),避光搅拌1 h,过滤后减压蒸馏得到白色固体。用乙醇稀释,在最大吸收波长下测定吸光度,根据cor的标准曲线计算包合物中cor的含量。

2.6 紫外可见光谱滴定实验

固定cor的浓度为0.02 mmol/l,按表1配制hpβcd的浓度,并分别采用na2hpo4柠檬酸、nahco3无水na2co3和na2hpo4nah2po4缓冲体系控制溶液的ph值为3.0、10.5和7.2,用乙醇水混合液(1∶4,v/v)和缓冲溶液定容,测定紫外可见吸收光谱。 移取一定体积的cor溶液,加入适量环糊精, 于两个25 ml棕色容量瓶中,用乙醇水混合液(1∶4, v/v)和缓冲溶液定容,其中缓冲液为ph=1.5的kclhcl溶液。在37℃恒温水浴中放置1 h,于最大吸收波长下,每隔(12±2) h测定一次吸光度。所有实验平行测定3次。

3 结果与讨论

3.1 job曲线

根据job法绘制job曲线(如图2所示),从曲线的最高点可以判断包合物的化学计量比。如果曲线的最高点为0.5,说明得到的包合物化学计量比为1∶1;如果最高点为0.67或0.75,则相对应的化学计量比为1∶2或1∶3。因此,从图3可以得出cor/hpβcd包合物的包合比为1∶1。

3.2 紫外可见光谱滴定

按照2.6节的方法,在200~800 nm下扫描紫外可见吸收光谱,得到cor/hpβcd包合物的紫外可见光谱滴定图(图3)。所有实验平行测定3次。

3.3 一维和二维核磁共振氢谱(1h nmr和2d nmr)

从图4可见,cor氢质子的化学位移δ在1.8~2.5 ppm、 4.2~4.5 ppm和5.5~8.5 ppm,可与环糊精的氢质子(δ 3.1~4.0和4.6~5.2)明显区分开来。通过计算cor的这些质子积分面积与hpβcd的h1积分面积,同样可以得到cor与hpβcd包合物的包合比为1∶1。图4 hpβcd(a)和cor/hpβcd包合物(b)在25℃下的1h nmr谱图(d2o,氘代水峰用星号标注)

3.4 热分析

由图7可见,cor(图7a)在228.5℃有一个尖锐的吸热峰,这是cor融化时的吸热峰,之后在278.0℃又出f一个吸热峰,该峰可能是cor的受热分解峰。hpβcd(图7b)在67.0℃处有一个非常宽大的吸热峰,这是hpβcd的脱水吸热过程。而从cor/hpβcd包合物的差热图(图7c)可发现2285℃和278.0℃这两个吸热峰消失了,说明作为自由态的cor已经不存在,同时hpβcd自身的宽大脱水吸热峰也变小了,这可能是因为cor进入hpβcd的空腔后,影响了水与hpβcd的结合。这也说明cor与hpβcd形成包合物后,热力学性质发生了改变。

3.5 xrd 粉末衍射

从图9可见,cor(图9a)呈晶型结构,hpβcd(图9b)呈无定形结构。而cor/hpβcd包合物(图9c)由部分晶型结构和无定形结构组成,但其晶型峰(2θ: 50~ 150)的位置较cor(图9a)的晶型峰发生向左偏移,峰的强度明显增强;同时其无定形结构部分(2θ: 150~ 350)与hpβcd(图9b)也有明显区别,这就说明形成的包合物具有新结构。

3.6 红外吸收光谱(ftir)分析

由图10可见,cor/hpβcd包合物(图10c)的谱图中有一些很小的特征峰与 cor(图10a)和hpβcd(图10b)有细微区别,在2920、1680、1610和1200~1500 cm

3.7 扫描电子显微镜分析(sem)

扫描电子显微镜常被用于物质表面结构的定性分析,从图11可见,cor呈棒状晶体(图11a),hpβcd是有空腔结构的球状晶体(图11b),cor/hpβcd的物理混合物有棒状和球状两种晶体结构存在,只是两种物质的相互混合(图11c);而cor/hpβcd包合物则呈现出不规则的块状晶体,其形状结构发生了明显的变化(图11d)。说明cor和hpβcd形成包合物后,表面晶形结构发生了变化。

3.8 cor/hpβcd包合物水溶性分析

据文献[3,9~11],cor的溶解度仅为4.3 mg/ml,按照2.5节的方法测定cor/hpβcd包合物的水溶性,经过计算得到其溶解度为170.5 mg/ml,表明cor与hpβcd形成包合物后,水溶性得到显著提高。

3.9 稳定性分析

为进一步对cor/hpβcd包合物的稳定性进行考察,以证明hpβcd作为cor载体的负载能力。按照2.7节的方法,在模拟人体的胃液环境(ph=1.5)下,测定了cor/hpβcd包合物的分解情况。从图12可见,cor溶液的紫外吸收值随着时间的增加而逐渐减弱,这表明在一定程度下cor会慢慢分解。而相比cor/hpβcd包合物来看,其在相同条件下吸光度变化较小,

这表明cor与hpβcd形成包合后,其稳定性得到提高。

4 结 论

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