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响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:1 热度: 8,170 ℃

阳光虫草

响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究

响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究

利用响应面法优化巴西虫草(cordyceps brasiliensis)液态发酵培养基。在预备实验的基础上,采用plankett-burman设计对影响巴西虫草菌丝体产量的液态发酵培养基组分进行了筛选,确定主要影响因子为葡萄糖和牛肉膏。再用最陡爬坡实验逼近以上2个因素的最大响应区域。最后通过中心组合设计和响应面分析法,确定了主要影响因子的浓度。优化后的培养基组成为:葡萄糖4.46 g/100 ml,可溶性淀粉2 g/100 ml,蚕蛹粉4 g/100 ml,牛肉膏2.93 g/100 ml,kh2po4 0.1 g/100 ml和mgso4・7h2o 0.15 g/100 ml。

巴西虫草;a发酵;a响应面法;a中心组合设计

s567.390.4a

冬虫夏草(cordyceps sinensis)是一种特异的虫菌复合体,其子座部分属真菌门(eumycota),子囊菌亚门(ascomycotina),核菌纲(pyrenomycetes),麦角菌目(clavicipitales),麦角菌科(clavicipitaceae),虫草属(cordyceps)。冬虫夏草为我国传统名贵的强壮滋补中药材,与人参、鹿茸齐名,在国内外享有盛名。冬虫夏草多生于海拔3000~4000 m的高山草甸土层中,由于其生长条件和寄生条件特殊,再加上人们不断采挖,生长环境不断遭到破坏,天然资源非常紧缺 [1]。为寻找天然冬虫夏草替代品以满足市场需求,国内外研究人员展开了大量的研究。1988年,广东省农科院蚕业与农产品加工研究所科技人员于自然保护区采集到虫草野生菌株,经广东省微生物研究所鉴定证实为巴西虫草 (cordyceps brasiliensis)。随后,有研究表明,巴西虫草菌丝体中氨基酸、微量元素和有效成份d-甘露醇、麦角甾醇、虫草多糖等的含量与天然的冬虫夏草相近[2]。通过液体深层发酵培养可以快速生产食药用菌菌丝体,缩短传统固体培养时间,节约生产成本,因此,以菌丝体生物量为指标,进行巴西虫草发酵培养基优化,具有重要意义。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株

巴西虫草98号菌株由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所保存。

1.1.2培养基

斜面培养基组成(/l):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,kh2po41.5 g,mgso4・7h2o 0.5 g,琼脂25 g,ph自然。

种子培养基组成(/l):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,kh2po41.5 g,mgso4・7h2o 0.5 g,ph自然。

初始发酵培养基组成(/l):葡萄糖30 g,蛋白胨10 g,kh2po41 g,mgso4・7h2o 1.5 g,cacl2 1.5 g,vb1 0.1 g。

1.2方法

1.2.1菌丝体干重测定

取1块6~10 mm2大小斜面菌种(26 ℃培养8~9 d)接入种子培养基中(装液量为100 ml/250 ml三角瓶,内装有已经干热灭菌的30粒直径为5 mm的玻璃珠),在120 r/min振荡摇床上26 ℃恒温发酵72 h,即得带有小菌丝球的种子液,再将小菌丝球以10%的接种量转接至发酵培养基中(装液量为100 ml/500 ml三角瓶),相同条件下培养96 h,得发酵液。

发酵液经真空泵抽滤,将湿菌丝体用蒸馏水洗净之后置烘箱中60 ℃烘至恒重,称重。

蔡友华,等:响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究

1.2.2plackett-burman(pb)设计

通过预备实验(碳源考察和氮源考察)可知,葡萄糖、淀粉、蚕蛹粉和牛肉膏对巴西虫草菌丝体产量有积极影响。采用pb两水平法[3]对发酵培养基8种成分进行考察,筛选影响巴西虫草菌丝体产量的重要因素,确定最佳配方,其实验因素、水平见表1。本阶段试验设计、数据分析和模型建立皆由sas version 8.1,0.9(sas institute inc)辅助完成。

1.2.3最陡爬坡实验

根据pb试验得出的一次拟合方程安排最陡爬坡试验。一次拟合方程中,各变量的系数决定爬坡方向和变化步长,如果系数为负,则该因素水平应为递减,反之为递增,系数越大变化步长越小。

1.2.4中心组合设计和响应面分析

根据box-wilson 的中心组合设计原理,以最陡爬坡试验得到的中心点,对pb试验确定的显著因素安排响应面分析试验[4]。本阶段试验设计、数据分析和模型建立皆由sas version 8.1,0.9(sas institute inc)辅助完成。

2 结果与分析

2.1pb试验结果

pb试验方案和结果见表2。用sas 软件对试验数据进行分析,得到各因素对响应值y(菌丝体干重,g/100 ml)的影响效果如表3所示,同时得到一次回归方程为:

根据表3中t-检验结果可知,在99%置信区间内,因素葡萄糖和牛肉膏的可信度分别为99.33%和99.48%,该方程的决定系数r2为97.53%,表明该回归方程拟合良好,可应用于分析和预测发酵过程中巴西虫草菌丝体的产量。

2.2最陡爬坡试验

由pb试验可知,淀粉、蚕蛹粉、kh2po4、mgso4・7h2o、cacl2和vb1在99%置信区间内对于液体发酵巴西虫草菌丝体产量没有显著影响,并且根据模型方程(1)可知,cacl2和vb1对响应值的贡献很小,因此,以淀粉、蚕蛹粉、kh2po4和mgso4・7h2o保持原水平不变,不加cacl2和vb1,对主要影响因子葡萄糖和牛肉膏进行爬坡,由模型方程1可知,葡萄糖(x1)和牛肉膏(x4)的系数均为正数,表明二者的试验水平上升,对响应值巴西虫草菌丝体的产量有积极作用,因此,设定x1和x4的变化步长分别为0.45 g/100 ml和0.30 g/100 ml。最陡爬坡实验设计和结果如表4所示。

由表4可知,最优条件在处理3和处理4之间,故采用x1=4.35 g/100 ml,x4=2.90 g/100 ml

为后续响应面试验的中心点。

2.3中心组合设计和响应面分析

淀粉、蚕蛹粉、kh2po4和mgso4・7h2o这些因素仍保持原始水平不变,根据爬坡试验得到的中心点,对x1和x4进行中心试验组合设计。为使拟合方程具有旋转性和通用性,中心点重复5次,星号臂长γ= 1.414。自变量水平及编码见表5 ,试验设计及结果见表6。

表5 中心组合试验变量和水平

table 5 factors and levels for the central composite

experiment (g/100 ml)

利用sas中的响应面回归命令对实验数据进行分析,得到二次回归方程各因子的偏回归系数估计值及方差分析结果见表7。

表7 回归方程中回归系数的估计值及方差分析

table 7 estimated partial regression coefficient values

and anova analysis

由此表可得到拟合的全变量编码水平的二次回归方程为:

y=2.822+0.076391x1+0.04091x4

-0.171625x21-0.005x1x4-0.219125x24(2)

该模型方程(2)的决定系数r2值为0.9164,表明该回归方程拟合良好,可应用于分析和预测发酵过程巴西虫草菌丝体的产量。由方差分析可知,二次项和一次项的影响都是显著的,而交互项在90%水平上不显著,表明此两因素交互作用小。方程二次项系数为负数,说明此方程有极大值,其表征的抛物面开口向下,回归方程(2)分别对x1和x4求一阶偏导,整理得如下二元一次方程组:

解得:x1=0.22,x4=0.091;即对应的非编码水平上葡萄糖和牛肉膏浓度分别为4.46 g/100 ml和2.93 g/100 ml。此时方程最大的响应值为2.83 g/100 ml,为证实预测值和真实值之间的拟合程度,以显著因子所取浓度进行摇瓶实验,三个平行所得菌丝体产量相近,平均值为2.78 g/100 ml,表明预测值和实验值之间有较好的拟合性,其立体分析图a和相应的等高线图b如图1所示。

3 讨论

通常优化培养基的方法主要包括单次单因子法和正交实验设计法。单次单因子法只是讨论一种因素的影响,由于考察因素间经常存在交互作用,所以该方法并非总能获得最佳的优化条件[3];正交实验设计则注重如何科学合理地安排试验,可同时考虑几种因素,寻找最佳因素水平组合,但它不能给出整个区域上因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程,从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最佳组合。国内外不少学者[5,6]通过响应面分析法在培养基优化方面取得了良好效果。本实验通过响应面分析法,以菌丝体产量为响应值,采用多元二次回归拟合方程,并通过求偏导获得了主要影响因子的最佳浓度配比。

试验结果表明,液体发酵培养基成分对巴西虫草菌丝体产量有较大影响,本文通过响应面分析获得了巴西虫草最优的发酵培养基配方:葡萄糖4.46 g/100 ml,可溶性淀粉2 g/100 ml,蚕蛹粉4 g/100 ml,牛肉膏2.93 g/100 ml,kh2po4 0.1 g/100 ml和mgso4・7h2o 0.15 g/100 ml。与初始发酵培养基比较,优化后培养基的菌丝体产量增加了1.3±0.5 g/100 ml。通过试验验证,在响应面优化后所获实际值与预测的最大响应值间拟合程度良好,表明中心组合设计和响应面分析法在培养基优化方面的应用具有实际指导作用。

陈晋安, 黄 浩, 郑忠辉, 等. 蛹虫草液体发酵条件的研究[j].集美大学学报(自然科学版), 2001, 6(3):219-222.

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[3] 褚以文. 微生物培养基优化方法及其opti优化软件[j].国外医药抗生素分册,1999 ,20(2):58-61.

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于荣利

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    2018-10-08 上午5:27 [回复]

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