阳光虫草

交配型基因作为分子标记鉴定蛹虫草退化菌株的核相初步研究

交配型基因作为分子标记鉴定蛹虫草退化菌株的核相初步研究

蛹虫草(cordyceps militaris)是一种具有开发前景的药用真菌,我国人工栽培蛹虫草技术已经成熟,并进入了产业化发展阶段。然而,目前在人工栽培过程中,蛹虫草菌种退化普遍且严重,给规模化栽培带来了极大的风险,阻碍了蛹虫草栽培业的进一步发展\[1\]。

蛹虫草是一种异宗配合的子囊菌,异核体所产生的有性后代中具有两种可亲和的交配型\[2, 3\]。真菌分子遗传学研究证明,蛹虫草的交配型因子具有典型的子囊菌交配型位点的idiomorph(同位异源)结构,即具有一个交配型位点,位点上存在着两类不同源的交配型基因,一类交配型基因是matalpha,该类交配型基因的序列有两种,被分别命名为mat111和mat112;另一类交配型是mathmg,该类交配型基因只有一种序列,被命名为mat121\[4\]。同核体仅仅含有其中的一类交配型基因,不能单独完成有性生活史,只有当可亲和的初生同核菌丝体之间发生质配后形成含有两类交配型基因的异核体,才能完成有性生活史,具备形成子实体的能力[5]。但该异核体是否会转变成次生的同核菌丝体从而导致产子实体能力的退化,是一个值得研究的内容。本文以蛹虫草的交配型基因为分子标记,鉴定供试菌株的核相,以期找到蛹虫草菌种发生退化的遗传学原因。

1 材料与方法

1.1供试材料

从栽培基地收集两批蛹虫草样品。第一批样品共12个,分别为同一菌株经不同批次传代接种后的样品(栽培条件相同),其中2个能形成正常的子实体(1号和2号),10个不能形成子实体(3号~12号),表型差异见图1。

a.不出草样品,b.出草样品

a. nonfruiting sample, b. fruiting sample

fig.1 phenotype of c. militaris samples from

the first batch

第二批样品共2个,在相同的栽培条件下,分别为形成茂密子实体(13号)和不形成子实体(14号)(┩2)。

a.茂密子实体,b.不形成子实体

a: luxuriant fruiting, b: nonfruiting

fig.2 phenotype of c. militaris samples from the second batch

1.2基因组dna的提取

采用改进的ctab法\[6\]提取所收集的蛹虫草栽培样品的基因组dna,具体操作参见文献\[7\]。

1.3μ匾煨砸物的设计

从genbank数据库中获得蛹虫草菌株ifo 9787的交配型基因mat121(登录号为ab084257)和菌株bcmu cm03的交配型基因mat112和mat111(登录号ab194982)的序列,并根据这些序列设计特异性引物,详见表1。

1.4扩增交配型基因的片段

分别以收集的两批共14个蛹虫草栽培样品的总dna为模板,以表1中所列的引物特异性扩增不同类型的交配型基因。100 μl pcr反应体系:100 ng dna, 1×pcr反应缓冲液,2 mmol/l mg2+, 0.2 mmol/l dntps, 0.25 μmol/l 上下游引物, 和3 u takara ex taq酶 (宝生物工程有限公司,大连)。反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,50~55 ℃ (温度根据引物的tm确定)退火60 s,72 ℃延伸40~60 s (时间根据扩增片段的长度确定),共32个循环;最后于72 ℃补平5 min。pcr反应在takara 450 扩增仪上进行。扩增产物分别用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2 结果和分析

运用pcr方法分别对两批蛹虫草样品的交配型基因类型进行鉴定,结果如图3、图4所示。根据扩增结果可知,图3中的1、2号样品和图4中的13号样品均可以扩增出对应于mat121、mat111和mat112基因的3条条带,既具有mathmg和matalpha两类交配型基因,表明这3个样品均为异核体。图3中的3~12号样品仅仅扩增出对应于mat111和mat112基因的2条条带,仅具有matalpha交配型基因;图4中的14号样品,仅扩增出对应于mat121基因的1条条带,即仅具有mathmg交配型基因,表明这11个样品均为同核体。

泳道m:marker,泳道1~12:1~12号样品的扩增产物;a图、b图和c图分别为引物mat111f/r、at112f/r和mat121f/r的扩增产物

lane m: markers, lanes 1~12:amplification products from samples 1~12; a, b and c were amplified by primer pairs mat111f/r,mat112f/r and mat121f/r, respectively

图3 第一批蛹虫草栽培样品交配型基因的pcr检测结果

fig.3 matingtype gene amplification products from the first batch of c. militaris samples

泳道m:marker,泳道13和14分别为13和14号样品的扩增产物;a图、b图和c图分别为引物mat111f/r、at112f/r和mat121f/r的扩增结果

lane m: markers, lanes 13 and 14: amplification products from samples 13 and 14, respectively; a, b and c were amplified by primer pairs mat111f/r, mat112f/r and mat112f/r, respectively

图4 第二批蛹虫草栽培样品交配型基因的pcr检测结果

fig.4 matingtype gene amplification products from the second batch of c. militaris samples

3 讨论

蛹虫草人工栽培主要集中于我国,对蛹虫草菌种退化问题的研究目前还只能引起中国科研人员的兴趣,而且目前对此问题的研究报道并不多见\[8\]。

影响蛹虫草形成子实体的主要因素可以分为两个方面,一方面是培养条件与环境因素,另一方面是菌株的遗传背景因素。在实际生产中,优良的蛹虫草菌株,随着菌种传代、转接次数的增加或保藏时间的延长,即使栽培条件没有变化,菌种也会表现出不分化子实体原基和畸形子实体增加等退化现象\[9\]。因此,蛹虫草菌种的遗传背景因素是子实体能否正常发育的决定因素,遗传背景因素的变化应该是导致菌种退化的根本原因。

本文通过pcr方法对14株蛹虫草栽培样品的交配型基因的类型进行鉴定,并根据结果判定了菌株的核相。试验结果表明,能够形成子实体的样品均同时具有matalpha和mathmg两种类型的交配型基因;不能形成子实体的样品仅具有matalpha或mathmg交配型基因其中的一类。即正常优良的蛹虫草菌种是以异核体形式存在的,而退化的蛹虫草菌种是以同核体形式存在的,所以蛹虫草菌种退化的遗传背景原因是核相发生了改变,即异核体变成了同核体。本试验结果表明,运用交配型基因作为分子标记来鉴定蛹虫草核相的技术手段是可行的。在本文研究结果的基础上,有望建立早期鉴别退化菌种的分子生物学技术,从而避免蛹虫草栽培中因使用退化菌种而发生较大的损失,进而促进蛹虫草规模化栽培的进一步发展。

本研究中,第一批10个退化菌株缺失的是mathmg交配型基因,第二批的1个退化菌株缺失的是matalpha交配型基因。由此可见,交配型基因的缺失可能是随机的。这种交配型基因缺失的原因和过程,有待于在今后的研究中探寻和证实。

宋金d,刘超,华秀红,等. 蛹虫草产业化栽培瓶颈及其对策[j]. 中国食用菌, 2009, 28(1):6264.

[2] shrestha b, kim hk, sung gh, et al. bipolar heterothallism,a principal mating system of cordyceps militaris in vitro[j].biotechnol bioproc engin, 2004,9(6):440446.

[3] 高新华.蛹虫草(cordyceps militaris)的交配型研究[j].食用菌学报,2008,15(1):15.

[4] yokoyama e, yamagishi k, hara a. structures of the matingtype loci of cordyceps takaomontana[j]. appl environ microbiol, 2003,69(8):50195022.

[5]高新华,吴畏,钱国琛,等.北冬虫夏草(cordyceps militaris)单孢菌株配对后对子实体形成的影响与无性型产孢结构关系[j].上海农业学报,2000,16(增刊):8592.

[6] 张红,秦莲花,谭琦,等. 用改进的ctab 法提取香菇基因组dna[j]. 上海大学学报(自然科学版),2006,12(5):547550.

[7] 鲍大鹏, 陈明杰, 张美彦. 香菇编码线粒体中间肽酶的基因片段的克隆及序列测定[j]. 食用菌学报, 2007, 14(4): 14.

[8] 李美娜,吴谢军,李春燕,等. 人工栽培蛹虫草退化现象的分子分析[j].菌物系统,2003,22(2):277282.

[9] 王升厚,王尊生,宋玉宏.蛹虫草人工栽培技术的改进[j].沈阳农业大学学报,1998,29(2):144147.

于荣利

distribution of matingtype genes in fruiting and

nonfruiting forms of cordyceps militaris

wang hong, wei jing, lin nan, feng aiping, chen mingjie, bao dapeng*

national research center for edible fungi biotechnology and engineering; key laboratory of applied

mycological resources and utilization, ministry of agriculture, people’s republic of china; shanghai

key laboratory of agricultural genetics and breeding; institute of edible fungi, shanghai academy of

agricultural sciences, shanghai 201106, china

fourteen cordyceps militaris specimens (three fruiting and eleven nonfruiting) were collected from a cultivation facility in shanghai in two separate batches (1st batch, two fruiting and ten nonfruiting; 2nd batch, one fruiting and one nonfruiting). three specific primer pairs, designed according to the reference mating type genes of c. militaris deposited in the ncbi database, were used to amplified mating type genes in the cultivated specimens. two forms of mating type genes were amplified from the three fruiting specimens but only one form of mating type gene was amplified from each of the nonfruiting specimens. among the latter, two matalpha genes (located at the same locus) were detected in the first batch of ten nonfruiting specimens, and the mathmg gene was detected from the nonfruiting specimen from the second batch. our data indicated that both matalpha and mathmg genes are required for fruiting in this fungus.

蛹虫草于2009年被批准成为新资源食品,提取成分被用于食药两用,未提取的草体目前仅见于用于食品及保健食品领域,其中的提取成分蛹虫草菌粉被用于药·品领域!
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冬·虫·夏·草为藏药材,食用需要谨慎或在医生的指导下服用,目前冬·虫·夏·草仅限用于药·品.
[1]冬·虫·夏·草在药·品领域的应用请见方解冬·虫·夏·草·药·品 栏目中详细介绍目前冬·虫·夏·草在药·品领域的应用!

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