阳光虫草

不同分子量段蛹虫草多糖的超滤分离及其对巨噬细胞释放no的影响

不同分子量段蛹虫草多糖的超滤分离及其对巨噬细胞释放no的影响

摘要:用超滤法将蛹虫草(cordyceps militaris)子实体水提物分为<10 kda(pw1)、10~100 kda(pw2)、100~300 kda(pw3)、300~750 kda(pw4)和>750 kda(pw5)5个部分,并测定了这5部分的总糖含量、单糖组成及其对巨噬细胞释放no产量的影响。结果表明,蛹虫草粗提物总得率(pw1~pw5之和)为38.35%,其中pw1得率最高(36.482%),其次是pw2(1.822%),pw3~pw5的得率都很低;各部分的总糖含量都较高(45.70%~60.48%)。单糖组成分析表明,各部分的多糖分别由3~6种单糖组成,其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主要单糖。pw2~pw5均具有刺激巨噬细胞释放no的活性,且随着浓度的增加活性增强。

关键词:蛹虫草; 超虑分离; 分子量; no产量; 巨噬细胞

蛹虫草(cordyceps militaris)又名北冬虫夏草,是一种最常见的药用价值极高的虫草菌,由于近年来大规模栽培的成功,越来越多地被用于医疗保健中[1]。蛹虫草子实体含有核苷类、多糖类、虫草酸、甾醇类等多种成分,其中虫草多糖具有免疫调节、抗肿瘤和抗衰老等多种活性[2]。多糖的生理活性与其结构、分子量大小等密切相关,而提取方法直接影响到多糖药用价值的开发和利用[3]。超滤是一种新型膜分离技术,利用不同的孔径截留不同分子量物质,具有常温操作、无相态变化,可以防止杂菌污染和热敏性物质失活等特点,近年来越来越多地被用于真菌多糖的提取、分离和纯化[3,4]。因此,笔者利用膜超滤法对蛹虫草子实体水提物进行分离,并考察不同分子量段粗多糖的单糖组成及对巨噬细胞释放no产量的影响,为阐明蛹虫草多糖的生物活性及分子量之间关系提供参考。

1 材料与方法

1.1σ牧嫌胧约

蛹虫草(c. militaris)子实体干品由张家港东方神草生物科技有限公司提供。标本存放于上海市农业科学院食用菌研究所药用真菌研究室。raw264.7巨噬细胞株由中国科学院细胞所提供。

rpmi1640培养基、dmem培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)为gibco公司产品;青霉素和链霉素购自amresco公司;细菌脂多糖(lipopolysaccharide, lps)为sigma公司产品;三氟乙酸为merck公司产品;其它试剂均为国产分析纯。

1.2ψ椒

1.2.1σ煌分子量段蛹虫草多糖的制备

蛹虫草子实体(2.5 kg)于蒸馏水中浸泡(料水质量比为1∶10)2 h,100 ℃提取2 h,过滤后滤渣重复上述操作1次,合并2次提取液,分别上分子截留量为750 kda、300 kda、100 kda和10 kda的超虑系统(quixstandtm, amersham biosciences),将粗提物按分子量大小分为750 kda(pw5)5部分,每部分加热浓缩体积至5 l左右,冷冻干燥,称重,计算得率。

1.2.2ψ芴呛量测定

采用苯酚-硫酸法测定pw1~pw5中的总糖含量[5]。

1.2.3φヌ亲槌刹舛

参考文献[6]的方法测定pw1~pw5的单糖组成。

1.2.4巨噬细胞释放no产量的测定

在无菌条件下将pw1~pw5用pbs(含0.14 mol/l nacl, 0.0027 mol/l kcl, 0.004 mol/l na2hpo4, 0.002 mol/l kh2po4, ph7.4)溶解并稀释成0.1、0.5和2.0 mg/ml的溶液(作用终浓度为10、50、200 μg/l),参考文献[7]的方法测定巨噬细胞释放no的产量。

2 结果与分析

2.1σ煌分子量段粗提物得率及其总糖含量和单糖组成

蛹虫草粗提物的总得率(pw1~pw5之和)较高,为38.35%,但其中95%为小于10 kda的部分。分子量为10~100 kda(pw2)部分得率为1.82%,多糖含量为43.70%,这部分含有较高比例的岩藻糖和鼠李糖。分子量大于100 kda(pw3~pw5)的部分在蛹虫草中的含量极低,仅为0.05%,单糖组成也较类似,主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成(表1)。

2.2σ煌分子量段粗提物对体外刺激巨噬细胞释放no产量的影响

体外刺激巨噬细胞释放no的实验结果表明,pw1没有活性,pw2~pw5都有良好的体外刺激巨噬细胞释放no的活性,且在试验浓度范围内,活性随着剂量的增加而增强,其中pw3的活性最好,但得率太低,pw2具有一定的活性且得率比较高(图1)。

3 讨论

研究发现分子量大于 100 kda的多糖具有较好的免疫调节活性,如灰树花子实体多糖的活性部位主要位于100~1000 kda范围之间[3,8],而细胞壁中含有大量活性多糖且分子量较大[9-11]。本研究中分子量大于100 kda部分(pw3~pw5)的含量极低,这可能是由于提取时所用的蛹虫草子实体未经粉碎,而使子实体细胞壁多糖未被充分提取,所以需采用粉碎、超细粉碎技术预处理子实体,使细胞壁多糖充分释放,以提高大分子量多糖部分的提取得率。研究发现,很多富含岩澡糖的多糖具有生物活性[12,13],pw2得率较高也具有生物活性且岩澡糖比例较高,因而值得进一步分离纯化。pw1得率最高,是低分子量多糖分离纯化的部分。笔者进一步分析了pw1的糖组成,发现这部分主要由甘露醇、海藻糖和小于10 kda的多糖组成,其中海藻糖约占39%。据报道分子量为8100和9874 da的虫草多糖有生物活性[14-16],pw1没有活性的原因可能是由于未去除其中小分子等杂质,因此,可将pw1进一步分离纯化后再考察这部分多糖的免疫活性[5,17]。お

都兴范,李亚杰,王林华,等.北冬虫夏草的研究发展现状[j].辽宁农业科学, 2003,(4):26-28.

[2] 宋江峰,刘春泉,李大婧,等.北冬虫夏草多糖活性研究进展[j].江苏农业科学, 2006,(4):145-147.

[3] 杨阳,刘承初,贾薇,等. 灰树花多糖的超滤分离及免疫活性研究[j]. 食品科学, 2008,29(9):277-280.

[4] 黄家利,陈元勇,唐庆九,等.七种食(药)用菌的超滤分级分离[j].食用菌学报, 2009, 16(4):64-65.

[5] 张维杰. 糖复合物生化研究技术[m]. 杭州:浙江大学出版社, 1999: 94-97.

[6] 吴迪. 灵芝子实体多糖的分离纯化、分子修饰及生物活性研究[d]. 上海:上海海洋大学,2010.

蛹虫草于2009年被批准成为新资源食品,提取成分被用于食药两用,未提取的草体目前仅见于用于食品及保健食品领域,其中的提取成分蛹虫草菌粉被用于药·品领域!
[1]蛹虫草在保健品领域的应用请见方解蛹虫草保健品 栏目中详细介绍目前蛹虫草在保健品领域的应用!
冬·虫·夏·草为藏药材,食用需要谨慎或在医生的指导下服用,目前冬·虫·夏·草仅限用于药·品.
[1]冬·虫·夏·草在药·品领域的应用请见方解冬·虫·夏·草·药·品 栏目中详细介绍目前冬·虫·夏·草在药·品领域的应用!

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