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高效液相色谱法检测蛹虫草胶囊中腺苷含量的方法研究

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:0 热度: 20,046 ℃

阳光虫草

高效液相色谱法检测蛹虫草胶囊中腺苷含量的方法研究

高效液相色谱法检测蛹虫草胶囊中腺苷含量的方法研究

摘要 建立了蛹虫草胶囊中腺苷含量检测的色谱优化方法。在260 nm的检测波长下,采用外标法对腺苷含量进行定量分析,在0.4~60 μg/ml线性范围内拟合线性回归方程:y=25.496 x+1.025,相关系数为0.999 7。方法的检测限为0.06 μg/ml,定量限为0.14 μg/ml。加标回收试验显示,回收率在96.9%~104.1%之间,rsd为3.43%。方法的精密度为1.02%。对试验结果进行统计分析,结果表明,260nm的检测波长能显著提高样品中腺苷含量测定值,结果更为准确、可靠。

关键词 高效液相色谱;蛹虫草胶囊;腺苷

中图分类号 o657.7+2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739(2011)12-0324-02

腺苷作为蛹虫草[cordyceps militaris(l.)link]中的主要功能成分,是一种生物来源的钙离子抗结剂和心肌收缩因子,具有调节中枢神经系统和抑制血小板聚集的功能。此外,腺苷对辐射造成的伤害也有一定的保护效果[1-2]。正因为腺苷有着极其重要的药用价值,《中华人民共和国药典》将腺苷作为了虫草的一种特征指标并规定其含量不得低于0.01%。而实际上,不同级别的蛹虫草中腺苷含量有显著性差异[3],蛹虫草和野生冬虫夏草中的腺苷含量也不尽相同[4]。目前,随着保健品市场需求量的急剧扩增及虫草资源的逐渐枯竭,虫草的质量问题已日益显现并日趋严重。因此,对蛹虫草中腺苷的含量进行检测,明确蛹虫草的质量,对规范中草药市场及巩固中药材生产的地位具有十分重要的作用。该文在保健食品评价技术规范[5]的基础上,对蛹虫草胶囊的前处理方法及样品检测的色谱优化方法进行了研究,使之更适合腺苷含量的定量分析,实现了高效准确的检测要求。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

腺苷标准品,纯度99.0%±0.5%,sigma试剂公司生产;磷酸二氢钾(分析纯),由国药集团化学试剂有限公司生产;甲醛(色谱纯),由德国merck公司提供;水相针式滤器(13 mm×0.45 μm),由上海安谱科学仪器有限公司生产。

1.2 试验仪器

agilent1200高效液相色谱仪:配有在线脱气机,四元泵,柱温箱,自动进样器,dad检测器,美国安捷伦公司;millipore milli-q academic纯水机,美国密理博(上海)贸易有限公司;电子天平:alc-210.4型,德国acculab;sigma离心机,3k15型,德国;超声波清洗器,kq-250e,昆山市超声仪器有限公司;hty-homo761匀浆机,杭州泰林生物技术设备有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件。色谱柱:agilent zorbax eclipse xdb-c18柱(5 μm,4.6×150 mm);流动相:甲醇:磷酸二氢钾(0.01 mol/l)=10∶90;流速:1.0 ml/min;检测波长:260 nm;进样体积:10 μl;柱温:20.0 ℃。

1.3.2 腺苷标准溶液的制备[5]。准确称取腺苷标准品0.020 0 g,加超纯水溶解并定容至50 ml,此溶液每1 ml含0.4 mg腺苷。分别从中吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 ml于100 ml容量瓶中,加超纯水定容至刻度,摇匀,即得0.4~60.0 μg/ml系列标准溶液。

1.3.3 样品溶液的制备。称取约0.25 g的已预先粉碎的样品于25 ml容量瓶中,加入20 ml纯水,超声提取30 min,定容至刻度,振摇混匀,于3 000 r/min离心5 min,经0.45 μm滤膜过滤后待测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

样品应少量称取,样品量过大在加水定容后不易混匀。如果样品一次称量过多,需放置冰箱中过夜,让样品缓慢分散均匀。超声波处理有利于样品中腺苷的提取,且随着提取时间的延长,提取率会显著增加然后逐渐趋缓[6],考虑到太长的处理时间会影响试验进度,选择超声波处理时间为30 min。

2.2 色谱分析条件的优化

参照《保健食品检验与评价技术规范 保健食品中腺苷的测定》[5],改变流动相组成、流速和检测波长,比较不同检测条件下的腺苷检测结果,同时进行统计分析,结果见表1。显然,无论是改变流动相中的有机相组分的比例还是改变检测波长,腺苷的检测结果均显著高于规范中方法的分析结果,特别是提高有机相的比例后,腺苷的检测值最高。在260 nm和250 nm处的腺苷检测结果彼此之间差异并不显著,无论是增加流速还是减少流速,得到的腺苷检测值均显著低于原分析方法的检测值,特别是减少流速后,腺苷的检测值降为最低。

考虑到增加及减少流动相中甲醇的比例,色谱峰峰型会发生显著变化,且影响色谱峰分离度。因此,保留规范中的流动相比例不变。改变流速后的腺苷检测结果要显著低于规范的检测结果,因而也保留规范中的流速不变。260 nm是腺苷的最大吸收波长,且相对原检测方法,此波长下的检测值显著增加。因此,选择260 nm的检测波长作为优化的色谱分析条件。

2.3 样品中腺苷的检测

蛹虫草胶囊样品及腺苷标准品溶液的色谱图见图1、2。由图可知,腺苷标准品的保留时间为11.182 min,与夏敏等[7-8]的液谱分析结果相似,通过将样品中腺苷的保留时间与标准品的进行对比,可实现腺苷的定性分析。样品中腺苷的保留时间与标准品相近,此外,样品腺苷的紫外光谱图与标准品的完全重合,因而可断定分析物为腺苷。在当前的色谱分析条件下,腺苷的分离度均在4.5以上,未受杂质峰的影响,运行情况良好。

2.4 线性范围

对浓度为0.4~60.0 μg/ml的腺苷标准溶液进行检测,以浓度为自变量,以峰面积为应变量,拟合线性回归方程:y=25.496 x+1.025,线性相关系数为0.999 7。 2.5 方法的检测限、定量限和回收率

将标准溶液进行逐渐稀释,当其产生的信号值分别为基线噪音6次重复性标准偏差的3倍和10倍时即为检测限和定量限。方法的检测限为0.06 μg/ml,定量限为0.14 μg/ml。

往空白样品中添加腺苷标准溶液,添加水平为5~20 μg/ml,按1.3.3的方法将每个水平处理3份,并按1.3.1的色谱条件将每个处理液重复进样5次,经计算,腺苷的回收率在96.9%~104.1%,rsd为3.43%。

2.6 方法的精密度和样品的稳定性

将样品溶液重复进样10次,以样品峰面积计算日内rsd,结果为1.02%,说明腺苷的检测方法在该实验室的精密度很好。将样品溶液在4 ℃的环境条件下连续放置7 d,峰面积rsd为4.96%,表明样品溶液在低温贮藏时较为稳定。

3 讨论

流动相的组成对腺苷的定量检测结果影响最大[9-10]。将流动相中甲醇的浓度提高到14.5%,蛹虫草中腺苷含量的检测结果则显著增加,这与丁献荣等[8]的分析结果相似,但其结果缺少统计分析的过程,最终得出了与原方法无明显差异的结论。该试验将流动相组成、流速、吸收波长作为影响因子,将样品中腺苷含量作为因变量,对各腺苷含量的均值进行单因素方差分析和多重比较,最终得出了差异显著的结论,为试验结果的可信度及色谱条件的优化提供了科学依据。

4 参考文献

[1] furuya t,hirotani m,matsuzawa m.n-(2-hy-droxyethyl)adenosine,a biologically active compound from cultured mycelia of cordyceps and isaria species[j].phytochemistry,1983,22(11):2509-2512.

[2] 何绍玉,李伟,郑毅男,等.林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析[j].药物分析杂志,2010,30(9):1701-1706.

[3] 刘志刚,颜仁梁,赵树进,等.不同级别人工蛹虫草腺苷含量的比较[j].解放军药学学报,2009,25(1):88-89.

[4] 米莉莉,张素文,孙家进,等.冬虫夏草及人工虫草核苷类成分的tlcs研究[j].中成药,2003,25(5):402-405.

[5] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范 保健食品中腺苷的测定[s].北京:中国标准出版社,2003.

[6] 甘宾宾,潘艳坤.hplc法测定保健食品中虫草素和腺苷含量[j].中国卫生检验杂志,2006,16(11):1310-1311.

[7] 夏敏,尹起范,温鲁,等.高效液相色谱法测定蛹虫草中腺苷和虫草素[j].理化检验:化学分册,2007,43(5):386-388.

[8] 丁献荣,提高兰,杨琳,等.高效液相色谱法测定保健食品中虫草素、尿苷和腺苷含量[j].分析与检测,2010,36(9):143-147.

[9] 殷明杰,刘应竹.高效液相色谱法测定保健食品中的大豆异黄酮含量[j].中国保健,2009(22):1074.

蛹虫草于2009年被批准成为新资源食品,提取成分被用于食药两用,未提取的草体目前仅见于用于食品及保健食品领域,其中的提取成分蛹虫草菌粉被用于药·品领域!
[1]蛹虫草在保健品领域的应用请见方解蛹虫草保健品 栏目中详细介绍目前蛹虫草在保健品领域的应用!
冬·虫·夏·草为藏药材,食用需要谨慎或在医生的指导下服用,目前冬·虫·夏·草仅限用于药·品.
[1]冬·虫·夏·草在药·品领域的应用请见方解冬·虫·夏·草·药·品 栏目中详细介绍目前冬·虫·夏·草在药·品领域的应用!

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