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人工栽培蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺流程

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:0 热度: 9,489 ℃

阳光虫草

人工栽培蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺流程

人工栽培蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺流程

摘要 蛹虫草是一种珍贵的药(食)用真菌,其功效与野生的冬虫夏草相似。目前已对蛹虫草子实体进行了人工栽培研究与示范。为了大规模化对蛹虫草子实体进行人工栽培,需要进行大量优质蛹虫草菌种培养液配备。因此,在已有研究的基础上,从优化发酵工艺方面入手,筛选出了最佳的发酵优化条件,提出了蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺的关键控制要点,并对蛹虫草菌株种子液发酵生产中菌株活化、接种、液体摇培、发酵罐调试、发酵罐封装灭菌、发酵培养、保存等方面提出了具体的、明确的技术要求,为批量制备蛹虫草菌种培养液提供技术依据。

关键词 蛹虫草;人工栽培;种子液;扩大生产;工艺流程

中图分类号 s567.35 文献标识码 b 文章编号 1007-5739(2016)21-0075-01

蛹虫草(cordyceps militaris)是一种珍贵的药(食)用真菌,寄生于鳞翅目昆虫蛹体后能形成真菌与昆虫复合体,属子囊菌纲,肉座菌目,麦角菌科,虫草属,与冬虫夏草(c.sinensis)同属异种,故又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草、蛹草菌等[1-4]。已有研究表明,蛹虫草子实体中具有多种药用成分如虫草素、多糖和虫草酸,具有滋肺益气、增精益肾、止血化痰、抑制肿瘤、延缓衰老、增强免疫力等作用,并在市场上得到广泛应用[5-6]。由于野生蛹虫草大面积采挖已面临枯竭,目前人工蛹虫草已广泛栽培,在蛹虫草的人工栽培条件、化学成分组成、药理作用、临床医疗保健功效等方面取得了较大进展[6-7]。笔者也从新疆地区采集野生蛹虫草子实体进行了分离得到优良菌株,进行了人工栽培研究与示范,也取得了较好的效果[8]。为了大规模化对蛹虫草人工栽培,需要对批量优质蛹虫草菌悬液进行制备,才能满足扩大再生产需要。为此,笔者在已有实验室装备和研究的基础上,从优化发酵工艺方面入手,对发酵罐中培养调节温度、ph值、通气量等因素进行了控制,筛选出了最佳的发酵优化条件,制备的种子液满足扩大再生产的需要。现对蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺流程进行了总结,以期为批量制备蛹虫草种子培养液提供技术依据。

1 供试菌株

供试菌株已经本实验室经单子囊孢子分离,进行分子生物学鉴定与人工筛选,获得了不同交配型mat1-1和mat1-2代表菌株[8-9]。

2 培养基制备

改良马铃薯(pda)固体培养基[10]:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨3 g,琼脂16 g,磷酸二氢钾(kh2po4)2 g,七水硫酸镁(mgso4・7h2o)1 g,复合vb 25 mg,用水补至1 000 ml,ph值 6.5~7.0。改良pd培养基(g/l):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氢钾2 g,硫酸镁1 g,复合vb 25 mg,ph值6.5~7.0。种子发酵培养基采用改良pd培养基。

3 工艺流程

3.1 倒平板

将改良型pda固体培养基加热熔化,待温度冷却至55~60 ℃时在无菌操作下倒入已灭菌的培养皿中,培养基冷却凝固后倒放备用。

3.2 活化

从冰箱中取出不同交配型mat1-1和mat1-2的蛹虫草优良菌种,在无菌操作下分别接种于改良型pda培养基上,恒温培养箱21 ℃±1 ℃光照培养15~20 d,待菌株长至近培养皿边缘时放置4 ℃冰箱备用。

3.3 接种

将长满菌株的培养基从冰箱中取出,无菌条件下用灭菌牙签挑取少量粉色的分生孢子,接种至装有灭好菌的改良pd液体培养基的锥形瓶中。

3.4 液体摇培

将含有不同交配型的接n好的锥形瓶放在摇柜中进行摇培,170 r/min,(21±1) ℃下恒温震荡培养3~4 d,获得许多含有小米粒的菌丝球的少量种子菌悬液。

3.5 种子液扩大生产

以liflus gx发酵罐为例,进行了蛹虫草菌株种子液扩大生产,具体如下。

3.5.1 发酵罐调试。

(1)ph电极405-bpas ph值校准。配制校准液(ph值分别为4.01和6.86),开机点主页面的calibration.继续ph calibration,先用蒸馏水润洗点击,再用餐巾纸擦拭,将配制好的标准液分别放入50 ml试管中,倒入15~20 ml即可。并将电极先后插入ph值6.86、ph值4.01的校准液中,静置与校准。

(2)溶氧电极inpro 6800溶氧电极准备。将溶氧电极的下端5 cm处电极头旋开,用拇指盖抵住电极头下端金属圈将其内部结构取出来。在取出来的内部结构中倒满极化液,注意不能有气泡,否则底部的膜会破。

3.5.2 发酵罐封装灭菌。清洗发酵罐liflus gx各个部位,然后将各个电极安装到发酵罐上,将适量酸、碱倒入瓶中,并注意用皮筋底部扎口,目的是防止腐蚀皮管和发酵罐。并将各个出口用封口膜紧紧封住,用报纸包住冷凝管灭菌,一般121 ℃灭菌15~20 min,完成后快速移到无菌操作台下紫外灭菌30 min。

3.5.3 发酵培养。在无菌条件下按灭菌好的发酵培养基:种子菌悬液为10~15∶1(体积比)的比例倒入发酵罐,封好后移出。连接各个电极,开通各个电源,通过蠕动泵调节酸、碱通过皮管到达发酵罐并调成自动模式。设置发酵条件(温度20~25 ℃,ph值6.0~6.5,通气量1 ml/min),培养2~3 d,菌丝球布满培养液,发酵完成。

3.5.4 种子液保存。对超净工作台灭菌30 min,将发酵完成的发酵罐移到超净工作台中,用酒精棉球擦拭整个发酵罐体,将菌种培养液倒入已预先灭菌好的玻璃容器内,并用标鉴标注时间、条件、工作人员等信息,放入4 ℃冰箱保存备用。

4 参考文献

[1] kirk p m,cannon p f,david j c,et al.dictionary of fungi[m].9th ed.wallingford oxon:cab international,2001.

[2] 蒋三俊.冬虫夏草及蛹虫草寄主昆虫资源[j].特种经济动植物,2001(5):15.

[3] 梁宗琦.中国真菌志:第32 卷:虫草属[m].北京:科学出版社,2007:1-19.

[4] zhou xw,gong zh,su y,et al.cordyceps fungi:natural products,pharmacological functions and developmental products[j].journal of pha-rmacy and pharmacology,2009,61:279-291.

[5] 孟泽彬,陈林会,朝近雨,等.蛹虫草化学活性成分的研究[j].分子植物育种,2015(9):2147-2154.

[6] 张姝,张永杰,shrestha bhushan,等.冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望[j].菌物学报,2013,32(4):577-597.

[7] shrestha b,han s k,sung j m,et al.fruiting body formation of cordyceps militaris from ulti-ascospore isolates and their single ascosp-ore progeny strains[j].the korean society of mycology,2012,40(2):100-106.

[8] 努尔买买提,焦子伟,杨晓绒,等.不同人工栽培培养基对蛹虫草子实体发育的影响及效益分析[j].新疆农业科学,2016,53(2):359-366.

[9] zhang g,liang y.improvement of fruiting body production in cordyceps mlitaris by molecular assessment[j].archives of microbiology,2013,195:579-585.

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