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苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:0 热度: 6,963 ℃

阳光虫草

苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量

苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量

【关键词】蛹虫草多糖;苯酚-硫酸法;含量

蛹虫草(cordyceps militaris),别名北冬虫夏草、北虫草。野生蛹虫草具有多种药用价值、滋补功能,可与人参、鹿茸相媲美。其所含的虫草素、甘露醇、sod等成分,均达到或超过名贵中药冬虫夏草。具有抗疲劳、抗衰老、增强免疫和性功能等作用,可杀灭喉癌细胞,能补肺益肾壮阳,有扶虚损、益精气、止血化痰、镇静、免疫等多种功能。其有效活性成分虫草多糖(cmps)被认为是非特异性免疫调节剂,可激活肌体的免疫活性细胞。本文通过苯酚-硫酸法,测定蛹虫草中多含量,此方法简便、结果准确、重现性好、颜色稳定。因此,可采用苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量。

1材料与方法

1.1材料

蛹虫草由抚顺师专生化系蛹虫草课题组提供。

1.2仪器与试剂

浓硫酸(gr)95%乙醇和无水葡萄糖均为市售分析纯。苯酚试剂: 取苯酚(cp> 200 g 、加铝片0.2 g和碳酸氢钠0.1 g,蒸馏,收集180 ℃左右馏分。将新蒸苯酚配成6%溶液,放入棕色瓶,置于冰箱中保存备用。其它均为分析纯。

unic7200型分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)

1.3方法

1.3.1蛹虫草多糖的提取与精制

新鲜的蛹虫草,烘干,粉碎后,用无水乙醇提取数次,残渣风干。取适量干粉,放于磨口三角瓶中,按料水比1∶20,在温度100 ℃的热水浴中回流浸提2 h,冷却后离心,合并上清液。上清液用酶法去除淀粉,按20 u/g加液化酶到上清液中,在ph为6,温度为65 ℃的水浴条件下处理,用i2/ki溶液检验,直到碘液不变色为止。接着用sevag法除去蛋白质,在水浴挥去有机相,h2o2除色,然后加3倍体积95%乙醇溶液,冷冻离心机离心,冷冻干燥即得精制cmps。

1.3.2葡萄糖标准曲线的测定

精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖100 mg,置于100 ml容量瓶中定容,摇匀。取10 ml溶液于100 ml容量瓶中定容,摇匀(含葡萄糖100 μg/ml),备用。分别吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 ml,用蒸馏水补充至2.0 ml加入5%的苯酚溶液1 ml,摇匀,加入浓硫酸5 ml室温下放置10 min,于490 nm处测定吸光度值(以2.0 ml蒸馏水作为空白),得到回归方程为:

a=0.009 1cr=0.997 6

其中:a为吸光值,c为葡萄糖浓度

1.3.3样品液的制备

称取用无水乙醇处理过的蛹虫草干粉10 g,按照最优提取方案进行提取,除淀粉,除蛋白,用95%的乙醇沉淀,4 000 r/min离心,沉淀用蒸馏水溶解,用500 ml的容量瓶定容,即得样品液。

1.3.4换算因子的测定

精密称取干燥至恒重的精制cmps粉末5mg,置于50 ml容量瓶中,加水溶解至刻度,摇匀备用。精密量取该贮备液1.0 ml,按照“1.3.2”的方法测定吸光度,计算出多糖中葡萄糖的浓度,按下式计算出换算因子,f=w/(c.d),w为多糖重量(mg),c为多糖中葡萄糖的浓度(mg/ml),d为多糖的稀释因素,测得f=2.031(n=3)。

1.3.5稳定性试验

取样品供试液,按葡萄糖标准曲线测定方法,将同一份反应液间隔一定时间,测定吸光值。

1.3.6精密度试验

取样品供试品溶液,按葡萄糖标准曲线所述的含量测定方法,重复测定5次,记录吸光值。

1.3.7回收率试验

采用加样回收法。吸取多糖样品溶液0.5 ml,分别加入标准葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0. 4 、0.5 ml,按照上述方法分别测其吸光度,根据葡萄糖的检出量,计算其回收率。结果见表1。回收率=(实验测值-样品所含被测成分量)/加入纯品量*100%

1.3.8多糖含量的测定

吸取样品液1.0 ml,用重蒸水定容至100 ml,取定容液1.0 ml,按上述步骤操作,同时做5个重复,测吸光度,以标准曲线和下式计算样品中多糖的百分含量。多糖含量(%)=c.d.f/w

c为供试液葡萄糖浓度,d为供试液的稀释因素,f为换算因素,w为供试品的重量。

2结果与分析

2.1稳定性试验结果间隔10、20、30、40、60 min测定的吸光度分别为0.448、0.449、0.448、0.450、0.449。稳定试验rsd为0.167% ,表明样品在60 min内稳定性良好。

2.2精密度试验结果测定1、2、3、4、5次吸光度值分别为0.445、0.443、0.447、0.444、0.445

精密度试验rsd为0.298% ,表明仪器精密度良好。

2.3回收率测定结果表1表明:本试验的rsd为0.36%,表明本方法的准确率较高。

2.4多糖含量测定结果表2表明:测得蛹虫草多糖含量为13.3%,rsd为0.21%,表明结果准确。

3小结与讨论

3.1本试验采用苯酚-硫酸法,此方法简便、结果准确、重现性好、颜色稳定。因此,可采用苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量。

3.2本试验在测定过程中发现,硫酸最好是用优级纯,同时在测定过程中无须加热,因为,在加入硫酸的过程中硫酸与溶液中水作用,放出大量热,完全能够满足反应需要。

参考文献

1徐锦堂.中国药用真菌学.北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1997:16-394.

2可世麟,赵春桂.苯酚-硫酸比色定糖法的应用.生物化学与生物物理进展,1986,(5):68-69.

3倪立坚,蒋小等.石斛中石斛多糖提取工艺的优选.海峡药学,2000,12(4):20-22.

4董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究.中国药学杂志,1996,31(9):550-551.

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