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蛹虫草虫草素高产原生质体融合子鉴定与筛选

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:0 热度: 6,127 ℃

阳光虫草

虫草虫草素高产原生质体融合子鉴定与筛选

蛹虫草虫草素高产原生质体融合子鉴定与筛选

以蛹虫草(cordyceps militaris)4号和8号菌株作为亲本,采用灭活原生质体融合技术获得228个再生菌株。酯酶同工酶与issr-pcr方法相结合鉴定融合子,以虫草素含量和子实体性状为筛选指标,经过初步的遗传稳定性测试,得到虫草素含量显著提高的5个稳定融合子――cm59、cm61、cm69、cm136和cm186,其虫草素含量分别为8号菌株的1.17~1.73倍。实验证明融合子菌丝中虫草素含量普遍提高。筛选得到的5个融合子经进一步遗传稳定性验证后可用于以获得虫草素为目的的菌丝体发酵培养。

灭活原生质体;a原生质体融合;a鉴定;a虫草素;a遗传稳定性

s567.390.1a

蛹虫草(cordyceps militaris)是一种典型的药用真菌,属子囊菌门(ascomycota),虫草属(cordyceps),有效成分主要有虫草素、虫草酸、虫草多糖等,并富含多种人体必需氨基酸和微量元素。选育蛹虫草优良菌株是规模化生产蛹虫草的基础,原生质体融合和原生质体诱变已被应用于虫草属真菌育种中,灭活原生质体融合方法尚未在蛹虫草育种中应用。

1 材料和方法

1.1供试菌株与培养基

蛹虫草4号菌株(原基分化早,分化率高)由上海市农业科学院食用菌研究所提供;8号菌株(子实体粗壮,生长整齐,虫草素及胞内多糖含量显著高于其它菌株)由贵州大学真菌资源研究室提供。

完全培养基(cym):葡萄糖20 g,蛋白胨2 g,酵母膏2 g,mgso4・7h2o 0.5 g,kh2po4 0.46 g,k2hpo4・3h2o 1.0 g,琼脂18 g,蒸馏水1000 ml。

栽培培养基:每瓶大米50 g,加70 ml营养液 (蛋白胨15.625 g,葡萄糖20 g,酵母膏6.25 g,马铃薯200 g,加水定容至1000 ml,ph自然)

固体再生培养基:麦芽糖10 g,葡萄糖4 g,酵母粉4 g,琼脂18 g,蒸馏水1000 ml。稳渗剂为0.6 m蔗糖。硫酸链霉素和青霉素钠各5万单位。

半固体再生培养基:同固体再生培养基,琼脂含量减半。

1.2灭活原生质体融合

酶解条件和融合条件见参考文献[1]和[2],略改动;4号菌株距离超净工作台紫外灯30 cm处灭活8 min,8号菌株60 ℃热水水浴灭活14 min(灭活时间,采用对照平板无再生菌落出现的最短处理时间),促融剂为peg。灭活原生质体融合后,25 ℃培养4 d,随机挑取228个再生菌株。

1.3虫草素含量测定

样品处理及高效液相色谱条件参考文献[6]和[7],略改动。采用varian高效液相色谱仪,依利特高效液相色谱柱sinochrom ods-bp;虫草素标样购于sigma公司。

1.4酯酶同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶4.0%,分离胶8.0%;菌丝体培养20 d;其它方法与参考文献[4]相同。

1.5issr-pcr反应

采用13条issr引物(表1)预实验后,选用p6、p22和p273条能同时扩增出亲本特有带的引物,退火温度分别为54.6 ℃、55.0 ℃和55.0 ℃。issr-pcr反应条件见表2和表3。

2 结果与分析

2.1酯酶同工酶酶谱分析

将随机挑取的228个再生菌株进行酯酶同工酶电泳分析,同时具有亲本菌株4号、8号特有带rf 0.225和rf 0.75的再生菌株共53个菌株。根据酯酶同工酶酶谱,初步判定这53个再生菌株为融合子(图1)。

2.2issr-pcr分析

对初筛的53个菌株进行issr-pcr反应,根据两个亲本特有扩增带的有无,从分子水平上对53个初筛菌株进行融合子鉴定。引物p6对53个初筛菌株扩增结果显示,20个菌株同时具有亲本4号、8号的特异带。

issr-pcr分析与酯酶同工酶酶谱相结合,确定f1、31、32、39、44、45、51、54、57、59、61、63、69、73、74、79、105、124、134、136、137、164、186、190、201和203共26个再生菌株是融合子。

2.3再生菌株虫草素含量测定

以虫草素浓度为x轴,峰面积为y轴进行回归分析,得回归方程:y = 6x×108+2×106,r2=0.9987,保留时间9.381±0.1 min,理论塔板数3486。

虫草素含量测定结果显示,53个再生菌株中,有4个菌株和虫草素含量低于和近似于4号亲本菌株,其它菌株均高于4号亲本菌株;有8个再生菌株的虫草素含量近似于8号亲本菌株,20个低于8号亲本,25个再生菌株含量高于8号亲本,其中22个菌株虫草素含量比8号亲本菌株高10%以上。

2.4再生菌株人工培养情况

根据虫草素含量及issr-pcr反应结果,选择36个再生菌株进行人工培养,观察其原基分化情况。4号亲本首先开始原基分化,24个再生菌株在8号亲本之前开始原基分化;4号亲本菌株首先长出幼嫩子实体,8个再生菌株在8号亲本前长出幼嫩子实体。1个再生菌株光照后不转色,13个再生菌株转色后无原基分化,19个再生菌株原基分化后未能长出子实体。

如图6所示,在各种融合子中,某些融合子仅形成数量极少的幼嫩子实体(b),长势亦不如亲本(d);某些融合子分化出簇集在一起的原基,与亲本(d)单生或双生子实体和原基明显不同,表现出双亲所没有的性状。融合子多数出现原基数量比亲本少和子实体较小的现象。初步试验表明,在以获得子实体为主要目标的育种中,原生质体融合并不十分有效。

部分融合子(a, b, c)和亲本8号(d)形成的原基和子实体

fig. 4 primordia and fruit bodies of selected protoplast fusion products (a,b,c) and parental strain 8 (d)

2.5遗传稳定性初步测试

在比较人工培养性状及虫草素含量的基础上,选择16个再生菌株连续转管4次进行培养,测定转管前后菌丝体虫草素含量。结果表明,在16个融合子中有14个菌株虫草素含量稳定, 59、61、69、136和186 五个菌株虫草素含量明显较高,融合子菌株命名为cm59、cm61、cm69、cm136和cm186,其各代菌丝体中虫草素平均含量分别为8号亲本的1.32、 1.17、 1.49、 1.73和1.33倍。经过进一步遗传稳定性测试后,高产融合子菌株有可能用于以获得虫草素为目标的菌丝体发酵生产。

3 讨论

由于亲本菌丝中遗传背景不同的细胞核经过原生质体融合而进入同一菌丝细胞中,理论上融合子应具备亲本所有的特异同工酶带,或在dna扩增反应中同时显示两个亲本的特异带,但融合子中是否能扩增出两个亲本的特异带,则与所用引物和扩增条件等因素有关。本研究中,通过issr-pcr与酯酶同工酶分析,从53个再生菌株中鉴定出26个融合子,但不能排除30个再生菌株中可能还有某些融合子。

初筛菌株虫草素含量普遍高于亲本菌株4号,较多的融合子虫草素含量甚至超过亲本菌株8号。在融合子异核菌丝中,极可能是亲本菌株8号的细胞核对融合子虫草素含量提高起到了主导作用。原生质体再生和紫外照射诱变本身就可作为育种手段提高变异几率。本试验所得到的融合子,经过酶解破壁、紫外照射和原生质体再生,基因型可能发生了较大改变,部分突变效应得到进一步积累,使虫草含量普遍提高。

融合子人工培养中,表现出双亲没有的性状,可能是因为不同来源的细胞核相互作用的结果。融合子菌丝体中不同来源的细胞核,必须经过相互作用和协调,才能正常地形成子实体。本研究中融合子的原基数量均少于双亲,子实体长势也不如双亲,表现出原生质体融合子结实困难的现象,表明在酶解破壁、紫外照射和原生质体再生等过程中,供试菌株的基因组可能受到外界理化因素的影响,致使原基大量形成和子实体高产的目标难以实现,这有待进一步深入研究。

融合子稳定性测定需要多次传代试验后,从活性物质含量、农艺性状等方面综合考察,并辅以继代培养菌丝体同工酶、issr-pcr的分析,从生产性状、蛋白质水平和分子水平上,确保筛选所得融合子的优良性状能稳定遗传,因此本研究所得到的5个融合子还需要进一步进行遗传稳定性研究。

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曹 晖

identification and selection of high cordycepin-yielding protoplast fusion products ofcordyceps militaris

zhou hongying1,abian yinbing2*

1industrial crops institute of hubei academy of agricultural sciences, wuhan, hubeia430070, china;

2institute of applied mycology, huazhong agricultural university, wuhan, hubeia430070, china

protoplast fusion was carried out between protoplasts prepared from two parental strains ofcordyceps militaris(strains 4 and 8) after the protoplasts from both parental types had first been inactivated either by exposure to 60 ℃ or to uv irradiation. a total of 228 putative fusion products were obtained following protoplast regeneration and confirmed as true protoplast-fusion products by esterase isozyme analysis and issr-pcr methodology. five regenerated fusion products, designated cm59, cm61, cm69, cm136 and cm186, were selected for increased and stable cordycepin production capacity. increased cordycepin production ranged from between 1.17~1.73-fold higher compared with the higher cordycepin-yielding parental strain 8. while most of the fusion products exhibited increases in cordycepin content, the five selected isolates appear to have a high potential for producing cordycepin in fermentation systems subject to further testing of genetic stability.

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