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蛹虫草菌丝固体法培养初探

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:0 热度: 5,250 ℃

阳光虫草

虫草菌丝固体法培养初探

蛹虫草菌丝固体法培养初探

摘要:试验采用点接法进行了蛹虫草菌丝适宜c、n源的筛选。结果表明,蛹草拟青霉可以利用的c、n源种类较多,常规饲料原料均可利用;根据c、n源筛选结果,设计了固体培养基配方;试验所设计的豆粕、麸皮、玉米面等固体配方可以满足蛹虫草菌丝生长的要求,蛹虫草菌丝的固体培养切实可行。

关键词:蛹虫草;菌丝;固体培养

中图分类号:s567.304.3 文献标识号:a 文章编号:1001―4942(2010)11―0066―03

众所周知,蛹虫草(cordyceps militaris)是一种名贵药材,含有多种生物活性成分,具有多种药理作用,是药用效果较好的保健食品。长期以来,蛹虫草菌丝产品主要是采用液体深层发酵的生产方式,从生产设备到最终产品后处理等环节都需要大量生产成本,导致目前市场上蛹虫草菌丝产品的价格偏高,制约了蛹虫草的生产和应用范围,比如在养殖业领域,利用蛹虫草研发绿色高效的饲料添加剂已取得进展,蛹虫草有望成为极具潜力的饲料添加剂。如何改进工艺,降低成本,则是能否实现蛹虫草在养殖业中应用的关键。本试验采用固体发酵培养蛹虫草菌丝的方法,首先进行了蛹虫草菌丝适宜生长的c、n源的筛选,在此试验基础上,又进行了三角瓶培养试验及曲盘培养试验,试图简化设备,降低成本,为蛹虫草菌丝固体法培养提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

蛹草拟青霉(paecilomyces militaris)由辽宁省微生物菌种保藏中心提供。

1.2 试验所需器皿及仪器设备

灭菌锅、培养皿、三角瓶、天平、移液管、无菌操作台、接种针。

1.3 试验方法

1.3.1 虫草菌丝适宜c、n源筛选

①培养基的制作:参考《微生物学试验》中的培养基配方。

唯一c源培养基:硫酸铵2.0g,硫酸镁0.2g,磷酸氢二钠0.5g,氯化钙0.1g,磷酸氢二钾0.5g,蒸馏水1000ml。常规灭菌后备用。唯一n源培养基:葡萄糖10g,硫酸镁0.2g,硫酸铁0.0005g,磷酸氢二钠2.13g,氯化钙0.005g,磷酸二氢钾1.36g,蒸馏水1000ml。常规灭菌后备用。

②孢子悬浮液的制备:将蛹虫草菌从试管中挑出,放人事前灭菌含有10ml无菌水的试管中,无菌条件下吸取一小滴,用血球计数板计数,计算孢子浓度。

③含菌平板的制作及点样:事先将灭菌的培养皿底用记号笔打上“+”,将培养皿均分为4块,无菌条件下倒入pda,待平板凝固后,每皿接种1ml孢子悬浮液,涂抹均匀,放置1h后,分别接种c、n源(c、n源明细见表1),使用灭菌的接种针蘸取少许,沾于培养基上,放置的位置尽量处于分区的中心位置,减少与其他营养源交叉的几率。按事先划好的分区每皿接种4种c源或n源,做好标记。以不接种任何c源或n源作为对照。每处理重复3次。置于25%条件下培养,及时观察菌丝的长势,并做好详细记录。

1.3.2 蛹虫草在固体培养基上的培养情况

培养基配方:1号培养基:豆粕8%,麸皮20%,玉米面72%等;2号培养基:豆粕20%、麸皮20%、玉米面60%等;3号培养基:豆粕40%、麸皮20%、玉米面40%等。

营养液配方:硫酸铵2%,硫酸镁0.5%,磷酸二氢钾0.5%。料水比1:1。

按上述配方制作培养基,分装于250ml三角瓶中,每瓶固含物约20g,常规灭菌30min,及时取出,将培养基振荡均匀,使之松散,能保持良好的透气性。待培养基放凉后,将菌液分别接种于1号、2号、3号培养基中,每处理5瓶,接种量为2ml。振荡均匀,于25℃下避光培养,及时观察记录生长情况。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草菌丝生长适宜c、n源筛选结果

由表1可以看出,蛹草拟青霉可以利用的c、n源范围较广。试验发现蛹草拟青霉对c源的要求不高,供试c源均能使其生长,其中较为适宜的有蔗糖、酒糟、玉米粉、大米粉、高粱粉、麦粒粉、甘薯粉等。在未接种c源部位菌丝生长非常微弱,几乎不生长。试验结果表明,n源对蛹草拟青霉生长影响大,除了硫脲不能为蛹虫草利用外,其他n源均可利用。其中较适宜的有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、酵母粉、豆饼粉、花生饼粉、蚕蛹粉、硫酸铵等。蛋白胨、牛肉膏、酵母膏比较适宜蛹虫草菌丝的生长,但高浓度时可能会由于渗透压比较高而抑制蛹虫草菌丝的生长,导致平板上出现了透明圈的现象。

综合本试验结果的固体培养条件、培养效果、成本、原料获得难易及营养需求等方面的因素,确定了以玉米面、麸皮和豆粕为主要原料设计固体培养料配方,并进行了固体培养初步试验。

2.2 蛹虫草在固体培养基上的生长情况

试验发现,在接种后24h时,在2号培养基和3号培养基上的虫草已有很明显的白色菌丝生长于物料表层,而在1号培养基上生长缓慢。在培养至第5天时,各培养基上蛹虫草菌丝的长势良好;且可以离瓶。本试验比较了不同配比的豆粕和玉米面对蛹虫草菌丝生长的影响,从试验结果可以看出,试验所设计的配方可以满足蛹虫草菌丝生长的要求,蛹虫草菌丝的固体培养切实可行。在本配方基础上,豆粕水平在20%―40%范围内对蛹虫草菌丝生长的影响不大。可以根据实际需要增减豆粕量。

3 讨论

本试验采用的是比较适宜大量筛选的点接法,操作中点样量不宜定量,有些观察结果不精准,但仍能比较明显的观察是否适宜菌丝的生长。试验表明,复合营养源比单一营养的利用情况好。c源浓度高也没有导致抑菌圈的出现,而n源中,牛肉膏与酵母膏浓度大时,可能由于具有较高的渗透压,出现了明显的透明圈,但外围菌丝长势旺盛,因此如果培养基中有此类成分要注意其浓度的把握。各复合氮源的利用情况较好,相比较而言,无机氮的利用情况很不理想,硫酸铵的利用情况一般,其他几类不宜利用。

在筛选c、n源的基础上,设计了固体培养料配方,并进行了初步的培养试验,结果表明,在培养周期为5天时,虫草菌丝可以吃透物料。试验所设计的配方可以满足蛹虫草菌丝快速生长的要求,蛹虫草菌丝的固体培养切实可行。

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