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冬虫夏草粉红菌株的分子鉴定

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:1 热度: 57,188 ℃

阳光虫草

冬虫夏草粉红菌株的分子鉴定

冬虫夏草粉红菌株的分子鉴定

摘要:在冬虫夏草真菌培养过程中,菌株sh-1菌丝产生粉红色变化的现象,粉红菌株zh-1与正常菌株sh形态存在很大差异。菌株sh-1与粉红菌株zh-1的its序列比对鉴定结果表明,11株sh-1和2株zh-1都能扩增出条带,条带清晰且稳定,分布在500~750 bp范围内,13株菌株在genbank中应用blast比对都与paecilomyces sp. cs-4(eu328187)的相似性达到了100%。用3种方法对13株菌株its序列与分离自冬虫夏草的32株真菌its序列(下载自genbank)构建系统进化树,3种方法都显示13株菌株与蝙蝠蛾拟青霉分为1支,可以确定粉红菌株zh-1与正常菌株sh-1为同一个种,即蝙蝠蛾拟青霉。

关键词:冬虫夏草;分子鉴定;粉红变化;its序列;系统进化树

中图分类号: s567.3+50.1 文献标志码: a 文章编号:1002-1302(2016)07-0059-05

冬虫夏草[cordyceps sinensis (berk.) sacc.]属真菌界(fungi)子囊菌纲(asocmycotetes)肉座菌目(clavicipitales)麦角菌科(clvaieipiacteae)冬虫夏草属(cordyceps)的冬虫夏草菌(cordyceps sinenss)寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1],《中华人民共和国药典》对其功用的描述是:“补肺益肾,止血化痰。用于久咳虚喘,阳痿遗精腰膝酸痛”。冬虫夏草主要分布在我国的青海、西藏、四川、甘肃等省(区)海拔3 000~5 000 m的部分地区,冬虫夏草是主产区群众经济财源的重要组成部分[2]。近年来冬虫夏草采挖严重过度,使冬虫夏草野生资源濒临枯竭,野生冬虫夏草生产面积正在逐年缩小,产量也随之大降[3]。

冬虫夏草人工培育的菌丝体成分、含量与天然冬虫夏草非常相似,是天然冬虫夏草最适替代品[4-6]。在本实验室静止培育冬虫夏草菌株sh-1的过程中,发现部分培养瓶内菌丝体生长到一定时期,从中间开始转化成粉红色,逐步蔓延到瓶壁,原先的粗糙表面变成有张力、有韧性的光滑表面,富含水分,周围又形成多层毛刺状结构,生长瓶内培养物往往形成一个整体,周围与瓶壁紧密结合,培养物颜色鲜艳,整体呈果冻状。把产生变化后的粉红色菌株编号为zh-1。

基因序列在生物进化过程中的改变速率是一定的,目前对真菌分子系统学研究的基础方法之一是对菌体的某一段dna序列进行同源性比较,构建系统树,以此探讨它们的系统演化关系。本研究利用its1-5.8s-its2序列构建系统进化树来验证正常菌株sh-1与粉红菌株zh-1的亲缘关系,为探讨产生粉红菌株的机理提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器、试剂

(1)供试菌种:冬虫夏草菌由青海省畜牧兽医科学院纯化培养,编号为sh-1,由sh-1转变来的粉红菌株编号 zh-1,保存于笔者所在研究室。(2)主要仪器:组培瓶、高压灭菌锅、超净工作台、多功能光照培养箱、fa1004电子分析天平。(3)分离用固体培养基(改良pda培养基):马铃薯 200 g,葡萄糖20 g,琼脂15~20 g,牛肉膏3 g,自来水补足至 1 000 ml,自然ph值。(4)培养用液体培养基:每200 ml溶液中含马铃薯20 g,胡萝卜10 g,氮源a 45 ml,氮源b 5 g,葡萄糖8 g,mgso4 0.1 g,k2hpo4 0.4 g。

1.2 方法

1.2.1 总基因组dna的提取 (1)样品的处理:取新鲜样品100 mg,用适量的液氮重复研磨3次,并加入溶液a 200 μl,用玻璃研磨器适当研磨,加入20 μl rnase a,再加入100 mg玻璃珠,在高速振荡器上振荡5 min。干品须在烘箱中干燥2 h,取50 mg进行上述操作。(2)加入20 μl 10 mg/ml的蛋白酶k,充分混匀,55 ℃水浴消化30 min。消化期间可颠倒离心管混匀数次,12 000 r/min离心2 min。将上清转移到1个新的离心管中,如有沉淀,可再次离心。(3)在上清中加入200 μl溶液b,充分混匀,如出现白色沉淀,可于55 ℃水浴5 min,沉淀即会消失,不影响后续试验;如溶液未变清亮,说明样品消化不彻底,可能导致提取的dna量少而不纯,还有可能导致上柱后堵柱子,可增加消化时间。(4)再加入200 μl无水乙醇,充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀,不影响dna的提取,将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中,放置 2 min。(5)12 000 r/min离心1 min,去除废液,将吸附柱放入收集管中。(6)向吸附柱中加入700 μl漂洗液,12 000 r/min 离心1 min,去除废液,将吸附柱放入收集管中。(7)向吸附柱中加入500 ml漂洗液,12 000 r/min离心 1 min,去除废液,将吸附柱放入收集管中。(8)12 000 r/min离心2 min,将吸附柱置于室温或50 ℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续试验,比如酶切、pcr等。(9)将吸附柱放入1个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50~200 μl经65 ℃水浴预热的洗脱液,室温放置5 min,12 000 r/min离心1 min。(10)离心所得洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2 min,12 000 r/min 离心2 min,即可得到高质量的基因组dna。

1.2.2 its rdna片段pcr扩增 利用真菌通用引物its4/5,以提取的总基因组dna为模板,把dntp、buffer、引物、无菌蒸馏水及聚合酶混匀后放入pcr仪扩增。初始变性温度为94 ℃,退火温度为40 ℃,共35个循环,获得产物是its4/5 rdna片段,经过琼脂糖凝胶电泳纯化后测序。引物[7]序列如下:its5:5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′;its4:5′- tcctccgcttattgatatgc-3′。 1.2.3 系统发育树的构建 从genbank核酸序列数据库中下载冬虫夏草及虫草属相关菌株的its序列(表1)。2株zh-1、11株sh-1与32个从genbank得到的相似序列文件经clustalx 2.0软件掐头去尾编辑后,由bioedit 7.0软件转换为fasta格式,再由mega 6.0软件进行比对分析并构建系统发育树,并进行1 000次bootstrap检验[8]。发育树构建方法有邻位相连法(neighbor-joining methods)、最大简约法(maximum parsimony methods)和最大似然法(maximum likelihood methods)[9-14]。

2 结果与分析

2.1 pcr扩增电泳结果

使用真菌dna基因组提取试剂盒提取2株粉红菌株wrf-11、wrf-12和11株sh-1菌株的dna,其its pcr产物经凝胶电泳均能扩增出目的条带,条带清晰且稳定,扩增产物大小均在500~750 bp之间(图1)。

2.2 its序列测序和比对结果

从系统发育树(图2)和各比对指标确定距离与同源性(表2至表5),可以看出粉红菌株zh-1和菌株sh-1在genbank中的相似序列都较多,最具鉴定意义的序列是paecilomyces sp. cs-4(eu328187.1),同源性达到了最高(blast中max ident都为100%);与其他蝙蝠蛾拟青霉paecilomyces hepiali(ef555097、af461743、kf297209)的相似性也在99%,可以认定菌株sh-1、粉红菌株zh-1在分类学上与paecilomyces sp. cs-4菌株是同种的,属于拟青霉属真菌蝙蝠蛾拟青霉。

3 讨论

利用分子生物学手段鉴定真菌的类别,首要的前提是样本的保存和提取质量好的真菌dna。由于冬虫夏草人工培育阶段的菌株sh-1和zh-1有性孢子获取困难,对鉴定是否是同一个种有一定的难度,所以选择比较容易的真菌菌丝提取dna。提取过程中发现,在液体培养基中培养3周左右,菌丝体dna的产量较高,对后期检测比较有利。

对2株zh-1菌株和11株sh-1菌株的dna分析中发现,虽然zh-1菌株和sh-1菌株以及sh-1菌株之间在液体培养时形态上有或多或少的差别,但是在分子水平上13个菌株的its保守序列差异极小,可以确定为同一个种。表明真菌存在形态多样性,在特定的环境中,真菌在形态和成分上会发生变化,但在遗传上没有太大变化。那么菌种变化的幅度有多大,需要经过多少时间、传多少代会失去活力变成另外一种形态?是不是菌种形态的变化也是一种生存策略,而不是因为退化老化?是不是存在菌株间的杂交引起的变化,或者是病害引起的变化?这些问题有待进一步研究。

2种性状的冬虫夏草菌株在同样的培养条件下,生长量是不一样的。前期(5~7 d内)菌株sh-1开始生长,菌丝体附着在瓶壁向内开始延伸,在菌丝体形成的平面中央闭合形成菌盖,并向上、下2个面继续生长。中期(7~26 d)一小部分正常菌丝尚未形成闭合状菌盖时,浸入到液体内的菌丝体由白色绒毛状变成透明状,再变为粉红状,这种菌丝体沿着从中心到瓶壁的方向把正常菌丝逐渐变成为粉红菌丝;一小部分正常菌丝形成菌盖后,由中部某一个点上发生这种变化,但大部分能够正常生长。后期(26~60 d)已转变成粉红色的菌株zh-1在外力破坏其生长环境时,如摇床等,部分可重新转变为为菌株sh-1生长,而未变化的菌株sh-1很少会出现粉红变化。同一种菌的形态转变是否跟环境胁迫有关联、是否与冬虫夏草形成过程中多菌联合侵染有关联,这些问题还有待进一步观察。

参考文献:

[1]梁宗琦. 中国真菌志:第三十二卷 冬虫夏草属[m]. 北京:科学出版社,1991:9-10.

[2]章力建,李 兵,胡育骄. 中国冬虫夏草资源管理概况[j]. 中国草地学报,2010,32(增刊1):1-5.

[3]刘锡q,郭英兰,俞永信,等. 冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定[j]. 菌物学报,1989,8(1):35-40.

[4]陈庆涛,肖生荣,施至用. 中国拟青霉新种及其与虫草的关系[j]. 真菌学报,1984,1(1):9-13.

[5]俞永信. 人工培养冬虫夏草研究[j]. 菌物研究,2004(2):42-46.

[6]刘作易. 虫草属及其无性型关系研究[d]. 武汉:华中农业大学,1999:1-180.

[7]朱佳石,郭英兰,姚艺桑,等. 冬虫夏草和中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉dna共存及竞争增殖力,化学成分变化[j]. 菌物研究,2007,5(4):214-224.

[8]何苏琴,王三喜,罗进仓,等. 冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢形态学再研究[j]. 微生物通报,2011,38(11):1730-1738.

[9]zhu j s,halpern g m,jones k. the scientific rediscovery of an ancient chinese herbal medicine:cordyceps sinensis:part ⅰ[j]. journal of alternative and complementary medicine,1998,4(3):289-303.

[10]chen j,zhang w,lu t,et al. morphological and genetic characterization of a cultivated cordyceps sinensis fungus and its polysaccharide component possessing antioxidant property in h22 tumor-bearing mice[j]. life sciences,2006,78(23):2742-2748.

[11]xiao w,yang j l,zhu p,et al. non-support of species complex hypothesis of cordyceps sinensis by targeted rdna-its sequence analysis[j]. mycosystema,2009,28(6):724-730.

[12]ni l q,yao y s,gao l,et al. density-weighted algorithms forsimilarity computation and cluster tree construction in the rapd analysis of natural cordyceps sinensis[j]. american journal of biomedical sciences,2014,6(2):82-104.

[13]李增智,黄 勃,李春如,等. 确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据[j]. 菌物系统,2000,19(1):60.

      [14]冬虫夏草在药品领域的应用请见方解冬虫夏草药品 栏目中详细介绍目前冬虫夏草在药品领域的应用!

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