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冬虫夏草中各种化学成分的检测方法

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阳光虫草

冬虫夏草中各种化学成分的检测方法

冬虫夏草中各种化学成分的检测方法

摘 要:阐述近五年来冬虫夏草中核苷类、甘露醇、多种氨基酸等成分的检测方法,其中包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法等方法。

关键词:冬虫夏草 化学成分 检测

冬虫夏草具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、免疫调节、保护受损肝肾、镇静抗疲劳等作用,冬虫夏草的化学成分复杂,近五年有关冬虫夏草化学成分测定方法的研究对象主要为核苷类、甘露醇、多种氨基酸、甾醇类及无机元素等。

1 核苷类物质的测定

核苷类物质为冬虫夏草的主要活性成分之一,具有广泛的生理功能,其中以虫草素、腺苷等具有明显的药理作用。近五年的测定方法主要为高效液相色谱法和毛细管电泳法。

1.1 hplc方法测定

中药成分非常复杂,hplc因其具有各种分析柱、高选择性和高灵敏度的检测器,所以具备分离效能高、分析速度快、灵敏度高和适用范围广等优点,所以成为中药研究的最重要的分析方法。郑永彪[1]等建立了冷冻保鲜冬虫夏草中尿苷和腺苷的hplc测定方法。采用waters sunfire色谱柱(4.6mm×250mm,4.6μm),流动相系统为乙腈和水的比例和体积流量的梯度洗脱程序,柱温35℃,检测波长260nm。结果尿苷和腺苷的线性范围分别为0.0340~0.340μg,0.00494~0.0494μg,平均加样回收率分别为98.70%(rsd为0.48%)、97.39%(rsd为1.6%)。该方法简便快捷、准确精密、重复性好,能用于冷冻保鲜冬虫夏草中腺苷和尿苷的同时测定。周伟平[2]等建立了采用agilent eclipsexdb-c18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱同时测定西藏产冬虫夏草中尿苷及腺苷的含量的方法,检测波长为260nm,以甲醇-水为流动相梯度洗脱,流速1.0ml/min,柱温33℃。尿苷及腺苷的线性范围为32.95~439.3μg/ml(r=0.9999)和3.486~46.48μg/ml(r=0.9999),平均回收率分别为98.5%、95.6%,rsd值分别为1.8%和2.4%(n=6)。来自西藏的23批冬虫夏草中尿苷的含量在1.209~2.192mg/g范围内,腺苷含量在0.0838~0.884mg/g范围内。该法简便、准确,重复性好,可快速测定冬虫夏草中尿苷和腺苷的含量,为控制西藏冬虫夏草的质量提供参考依据。李秀敏[3]等建立了hplc法测定中药免疫调节方冬虫夏草中腺苷的含量的方法。采用c18色谱柱hypers ldsc 18mm(4.6mm×250mm,5μm),流动相水-甲醇(85:15),流速1ml/min,检测波长260nm,进样量10μl,柱温25℃。样品预处理方法以在室温下用体积分数50%的甲醇超声波提取60min。结果冬虫夏草中的腺苷质量分数为0.097~0.582mg/ml与峰面积呈良好线性关系。腺苷平均加样回收率为100.88%,rsd%=1.43%。该方法可用于中药免疫调节方冬虫夏草中腺苷的含量测定。梁洪卉[4]等建立了冬虫夏草核苷类物质的微量提取方法,在优化的hplc-uv色谱条件下,鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷和虫草素等5种冬虫夏草主要核苷类物质的标准品分离完全。精密度、稳定性和回收率实验表明,用hplc-uv方法即可定量分析冬虫夏草的核苷类有效成分。用该方法检测到这5种核苷类物质含量在冬虫夏草子座部分与其虫体部分之间以及冬虫夏草居群间存在显著差异。结果表明冬虫夏草主要核苷类成分的有效定量分析方法的建立对冬虫夏草的品质评价及质量控制具有重要的现实意义,也为进一步研究影响冬虫夏草品质的因素并建立品质评价体系奠定了基础。

虫草素,即3,-脱氧腺苷(3,-deoxyadenosine)为含氮配糖体的核酸衍生物,属嘌呤类生物碱,是一种核苷类抗生素。虫草素具有抑制微生物生长、抗肿瘤、调节免疫、抗炎等药理作用[5],宋江峰[6]等建立了测定北冬虫夏草子实体中虫草素的高效液相色谱法。使用eclipse xdb c18 (4.6mm×150mm,5μm)色谱柱,以水:甲醇:甲酸(95:4:1)为流动相,流速为0.8ml/min,25℃下检测,检测波长为260nm。结果表明虫草素的平均回收率为100.8%,rsd值1.88%,此方法简单、可靠。刘小芳[7]等建立了一种新的反相高效液相色谱方法,用于蛹虫草中腺苷和虫草素的定性定量分析。样品经水超声提取,以终浓度20mmol/l柠檬酸、40mmol/l醋酸、20mmol/l三乙胺的混合溶液-乙腈(体积比98:2)为流动相,流速1.0ml/min,色谱柱capcellpak c18(150mm×4.6mm,5μm)分离,柱温40℃,进样量10μl,紫外检测波长260nm。在此条件下,腺苷在1~1000μg/ml范围内有良好的线性关系,检测限0.2μg/ml,回收率93.75%~96.90%,rsd为0.116%;虫草素在2~1000μg/ml范围内有良好的线性关系,检测限0.2μg/ml,回收率92.03%~97.35%,rsd为0.104%。该方法样品处理简便、分离度高、杂质干扰小、回收率高、重复性好,能够对蛹虫草中腺苷和虫草素进行准确的定性定量分析。

1.2 毛细管电泳法测定

郭怀忠[8]等采用聚甲基丙烯酸丁酯(pbma)整体柱毛细管电色谱法测定冬虫夏草中胞苷和腺苷的含量。采用自制的pbma电色谱整体柱(总长为34.5cm,有效长度26.0cm),流动相20mmol/l硼砂水溶液(ph3.5),运行电压15kv,压力进样(6×105)pa×0.1min,柱温30℃,检测波长214nm,内标溶液100μg/ml甲氧苄啶(tmp)溶液(乙醇-流动相1:1为溶剂)。检测结果为两核苷在12.5~125mg/l线性关

系良好。检测限为(s/n=3)及定量限(s/n=10)分别为:胞苷2.14mg/l,7.14mg/l;腺苷1.88mg/l,6.25mg/l。两核苷加样回收率在97.2%~103.5%,rsd在0.9%~2.6%。祝玲[9]等应用毛细管区带电泳法测定分别以冬虫夏草菌丝体粉和鹿茸血为主要原料制品中的多种核苷和碱基成分。对实验条件进行了优化,结果表明,以20mmol/l硼砂-15mmol/lβ-环糊精为缓冲溶液(ph=9.4),分离电压22kv,检测波长254nm,电动进样为10kv、5s时,在10min内同时分离测定了虫草素、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷和肌苷。各组分在0.2~200μg/ml范围内呈线性关系,检出限范围0.07~1.67μg/ml。5个批次的冬虫夏草菌丝粉保健品中腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷5组分的定量结果分别在0.15~0.19mg/g、0.72~0.92mg/g、1.44~1.59mg/g、1.51~2.32mg/g和1.77~2.56mg/g范围内,加标回收率的范围是82.83%~109.21%;2个批次的鹿茸血保健品中次黄嘌呤、尿苷的定量结果在36.55~49.97ug/ml和86.08~108.97ug/ml范围内,加标回收率的范围分别是89.68%~96.79%和99.05%~102.81%。阎正等[10]探索冬虫夏草不同的预处理方法,以便更好地反映冬虫夏草的谱图信息。方法采用不同的预处理方法,比较操作方法和所得样品溶液。通过比较发现,在以下电泳条件及改进索氏提取法所得谱图峰形好,信息多。电泳条件:未涂渍弹性石英毛细管(75μm×60cm),缓冲溶液40mmol/l硼砂溶液,电泳电压20kv;进样时间3s,室温,检测波长250nm。通过比较多种预处理方法,上述预处理方法操作简便,所得溶液澄清透明。史倩[11]等对毛细管电泳法分离15种核苷类化合物所用的不同缓冲液体系进行了系统比较,确定不同模式毛细管电泳法分析多种核苷类化合物的最适合背景缓冲液体系(bge)。分别以四硼酸钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、碳酸氢钠、乙酸铵和乙二胺(dea)为背景电解质,对毛细管区带电泳(cze)、毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱(ce-esi-tof/ms)以及胶束电动毛细管电泳(mekc)3种模式进行比较,并对其中几种优势缓冲体系进行了优化。刘玉军[12]等建立了简单、快速测定冬虫夏草和人工蛹虫草子实体中虫草素、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、次黄嘌呤、腺苷、鸟苷、尿苷、次黄苷9个核苷及碱基类成分的高效毛细管区带电泳法,比较天然冬虫夏草与人工蛹虫草子实体中核苷及碱基类化合物的含量。方法采用未涂层熔硅弹性石英毛细管(75um×60.5cm,有效长度50cm),以ph9.0的0.05mol/l硼砂-硼酸(8:2,含硼酸根的浓度为0.2mol/l)作为缓冲体系,分离电压20kv,温度20,检测波长258nm,进样量为3.445kpa,进样5s。结果在优化的实验条件下,冬虫夏草及人工蛹虫草子实体中上述9个核苷及碱基类成分在15min内达到基线分离;核苷及碱基类成分的浓度在1.0~205.5μg/ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系,相关系数为0.9995~0.9999,样品回收率为95.3%~106.5%。结果表明人工蛹虫草子实体与天然虫草有相似的核苷及碱基成分,但在含量上有较大差异。新建的方法操作简便,实验消耗低,高效而快速,可以成为冬虫夏草及代用产品中核苷及碱基类成分检测的一种简便、价廉、有效的分析方法。 2 氨基酸含量的测定

冬虫夏草中含蛋白质20.06%~26.40%,由天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、缬、蛋、异亮、亮、酪、苯丙、赖、组、胱、半胱、精、色氨酸18种组成。以精氨酸、谷氨酸、色氨酸及酪氨酸等为药理学主要成分,氨基酸是虫草补益强壮作用和增强免疫功能的物质基础之一,王丽[13]等建立了一种快速测定冬虫夏草中氨基酸含量的hplc方法。采用柱前邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯联合在线自动衍生,二元梯度洗脱(流动相a:40mmol/lnah2po4、h2o,ph7.8、流动相b:乙腈-甲醇-水=4.5/4.5/1,v/v),反相c18短柱分离(zorbax eclipse aaa c18色谱柱、75mm×4.6mm,3.5μm),二极管阵列检测器(检测波长338nm、参考波长390nm)和荧光检测器(激发波长340nm,发射波长450nm)联合检测,内标法定量。结果各氨基酸含量在4.5~1000μmol/l范围内线性关系良好(相关系数为0.9914~0.9997),除蛋氨酸(部分氧化降解)为85.12%外,其他各氨基酸的加标回收率为95.10%~103.29%,相对标准偏差2.03%~5.12%(n=5)。李建平[14]等为研究冬虫夏草游离氨基酸的测定方法,利用液相色谱建立了冬虫夏草中游离氨基酸的分析方法。以0.1mol/l盐酸为萃取剂,0.2ml1.0g/l的l-正缬氨酸为内标溶液,超声萃取20min,以邻苯二甲醛为衍生化试剂,watersc18色谱柱进行分离,荧光检测器进行检测。回收率94.62%~101.44%,rsd=1.06%~4.61%(n=6)。该方法简便、准确、重现性好,适于冬虫夏草中游离氨基酸的分析。

3 其他成分的测定

3.1无机元素的测定

卢钢[15]等采用icp-aes法测定北冬虫夏草中无机元素,结果该方法的加标回收率为97.5%~108.6%,rsd为0.10%~4.30%,检出限为0.0004~0.0945mg/l,具有良好的准确度和精密度。结论北冬虫夏草中cu、mn、mg、k、fe元素含量较为丰富,实验结果为北冬虫夏草中元素含量与其药效的相关性提供科学数据。

蔡立鹏[16]等用icp-aes测定了7产地人参、6产地鹿茸和4产地冬虫夏草中的p、b、zn、fe、cu、na、k、mg、mn、ca10种元素的含量,比较了k与na、ca与mg、zn与cu、fe与mn、p与b的含量比例关系。结果表明不同产地人参、鹿茸和冬虫夏草的10种元素的5个比例值存在显著性差异。此结果可用来鉴定是否为原产地人参、鹿茸及冬虫夏草。

3.2甘露醇、麦角甾醇的测定

石岩[17]等建立冬虫夏草药材中麦角甾醇的rp-hpl c含量测定方法。冬虫夏草药材粉末经甲醇超声提取后,用rp-hplc测定。采用phenomenex luna c18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-水(98∶2);流速为1ml/min;检测波长为282nm。检测结果麦角甾醇进样量在0.04272~0.4272μg与峰面积呈良好的线性关系,麦角甾醇的平均回收率为98.7%(n=6)。采用此方法测定冬虫夏草药材中麦角甾醇的含量,方法灵敏、快速、准确。涂永勤[18]采用水提回流离心的方法,提取分离人工培殖冬虫夏草中d-甘露醇,用高碘酸钠与甘露醇反应产生黄色的3,5-二乙酰-1,4-脱氢二甲基吡啶,在波长412nm处测定其最大吸收。甘露醇浓度在10~50mg/l之间时,与吸光值有良好线性关系,线性方程为c=79.172x-0.0713,相关系数r=0.9999。人工培殖冬虫夏草中d-甘露醇的含量分别为89.64mg/g

(2005年)、91.86mg/g(2006年)、94.71mg/g(2007年)、98.98mg/g(2008年)、97.50mg/g(2009年)、94.71mg/g(野生)和96.84mg/g(野生)。

3.3其他测定

陈璐[19]等比较凉山虫草与冬虫夏草在多糖含量上的差异,为凉山虫草的资源开发利用提供依据。采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖为对照品,测定凉山虫草与冬虫夏草中多糖含量。测定结果凉山虫草样品多糖含量分别为1.30%、1.44%,冬虫夏草样品多糖含量分别为2.02%、2.27%。凉山虫草中含有丰富的多糖成分,含量低于冬虫夏草。钟欣[20]等采用核糖体基因(rdna)测序和高效液相色谱(hplc)指纹图谱对冬虫夏草、亚香棒虫草及市场中贩卖的所谓“冬虫夏草”样品进行检测。结果显示冬虫夏草与亚香棒虫草的rdna序列相似度为80.5%~81.0%,hplc指纹图谱的相似度低于47.9%,市场中贩卖的所谓“冬虫夏草”,实质上是亚香棒虫草。

参考文献

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