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人工虫草与冬虫夏草hplc特征图谱研究

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:3 热度: 7,685 ℃

阳光虫草

人工虫草与冬虫夏草hplc特征图谱研究

人工虫草与冬虫夏草hplc特征图谱研究

摘要:目的 以人工北虫草、发酵虫草菌粉和冬虫夏草为研究对象,建立高效液相色谱(hplc)特征图谱。方法 采用超声法提取虫草中的水溶性成分,hplc建立虫草的特征图谱。采用agilent zorbax sb-aq色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈(a)-0.04 mol/l磷酸二氢钾溶液(b),梯度洗脱(0~16 min,0%a;16~38 min,0%→10%a;38~58 min,10%→15%a;58~65 min,15%→0%a),流速1.0 ml/min,柱温25 ℃,检测波长260 nm,进样体积20 μl。运用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 a)》,建立人工虫草与天然虫草hplc特征图谱,同时指认了7个核苷类成分,并进行比较研究。结果 本方法精密度、重复性、稳定性良好。以腺苷为参照峰,对11批冬虫夏草、10批人工北虫草和12批发酵虫草菌粉进行指纹图谱分析结果显示,其指纹图谱相似度分别为0.889~0.982、0.781~0.980、0.502~0.970。结论 天然虫草的指纹图谱相似度较高,人工北虫草和发酵虫草菌粉指纹图谱的相似度较低。本方法可作为评价人工虫草和天然虫草质量的参考依据。

关键词:人工北虫草;发酵虫草菌粉;冬虫夏草;指纹图谱;高效液相色谱法

doi:10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.025

中图分类号:r284.1 文献标识码:a 文章编号:1005-5304(2015)08-0092-05

comparative research on hplc characteristic fingerprint of cultured cordyceps militarise and cordyceps sinensis zhang wei-wei, gong tao, han dong-he (beijing clinical medicines institute, beijing 100035, china)

abstract:objective to establish fingerprints of cultured cordyceps militaris, cordyceps sinensis and fermental cordyceps. methods water soluble components in cordyceps sinensis were extracted by ultrasonic method. the characteristic fingerprints were established by hplc, with agilent zorbax sb-aq (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) as column and acetonitrile (a)-0.04 mol/l kh2po4 (b) as mobile phase;gradient elution (0-16 min, 0%a;16-38 min, 0→10%a;38-58 min, 10%→15%a;58-65 min, 15→0%a);the flow rate was 1.0 ml/min;column temperature was 25 ℃;the detection wavelength was 260 nm;the injection volume was 20 μl. the hplc characteristic fingerprint of mycelium was developed, and the components of adenosine, uridine, guanosine, inosine, uracil, adenine and cordycepin were identified and compared. results this method is with high degree of precision, good repeatability and stability. with adenosine as reference peak, similarity of 11 batches of cordyceps sinensis collected from different habitats, 10 batches of cultured cordyceps militarise and 12 batches of fermental cordyceps were 0.889- 0.982, 0.781-0.980 and 0.502-0.970, respectively. conclusion there were good similarities between the standard fingerprint and each fingerprint of the eleven samples of cordyceps sinensis. there were low similarities between the standard fingerprint and each fingerprint of the ten samples of cultured cordyceps militaris and the twelve samples of fermental cordyceps. this method can be reference base for the evaluation of quality of cultured cordyceps militaris and cordyceps sinensis.

key words:cultured cordyceps militaris;fermental cordyceps;cordyceps sinensis;fingerprint;hplc 基金项目:北京市中医药科技发展基金项目(jj2009-14)

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌cordyceps sinensis (berk) sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,具“保肺益肾,止血化痰,已劳嗽”之功,主产于我国青海、西藏、四川、云南等省海拔3500~5000 m的高原高寒草甸。药理研究表明,冬虫夏草具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种药理作用[1]。近年来,从天然北虫草中分离得到拟青霉paecilomyces militaris的菌种,经人工培养获得人工北虫草。采用天然虫草真菌发酵法获得人工虫草菌粉。冬虫夏草人工培养物制剂已广泛应用于临床[2-6]。虫草的物质基础丰富,含有氨基酸、核苷类、虫草多糖、虫草酸、甾醇类等。目前,冬虫夏草及人工虫草的质量控制尚无统一方法。本研究建立虫草高效液相色谱(hplc)指纹图谱分析方法,通过分析人工虫草和冬虫夏草中水溶性成分的特征图谱,研究人工虫草和天然虫草的成分差异及质量状况,为虫草的质量控制及进一步开发利用虫草资源提供依据。

1 仪器与试药

shimadzu lc-20a高效液相色谱仪(日本岛津公司),solution工作站,spd-20a 检测器,agilent zorbax sb-aq(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;mettler toledo xp105 电子分析天平;millipore milli-q plus超纯水系统;kq-500db型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);anke tgl-16c高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

对照品腺苷(批号110879-200202)、肌苷(批号1406692-201104)、虫草素(批号858-200202)购于中国食品药品检定研究院,尿苷(批号030m5309v)、鸟苷(批号120m1018v)、腺嘌呤(批号021m0181v)、尿嘧啶(批号080m0067v)购于sigma-aldrich;乙腈(hplc grade),美国fisher scientific;水为超纯水。

冬虫夏草药材:冬虫夏草1(西藏),冬虫夏草2~5(购于北京白塔寺药店),冬虫夏草6~10(购于北京同仁堂药店),冬虫夏草11(青海),由北京市卫生局临床药学研究所中药化学室鉴定,符合2010年版《中华人民共和国药典》要求。人工北虫草:北虫草1(北京市卫生局临床药学研究所),北虫草2(吉林蚕业研究所),北虫草3(山东烟台惠众生物科技有限公司),北虫草4~10(购于北京超市)。发酵虫草菌粉:百令胶囊1~6[青海珠峰虫草药业有限公司,批号20120201 (0.5 g/粒)、20120202(0.5 g/粒)、20120203(0.5 g/粒)、20120201(0.2 g/粒)、20120202(0.2 g/粒)、20120203 (0.2 g/粒)],百令胶囊7~12(杭州中美华东制药有限公司,批号101041、091222、090425、100147、100551、110437)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

agilent zorbax sb-aq色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流动相a为乙腈、b为0.04 mol/l磷酸二氢钾溶液,梯度洗脱(见表1),检测波长260 nm,柱温25 ℃,流速1.0 ml/min,进样体积20 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷、虫草素对照品,加0.5%磷酸溶液制成每1 ml分别含0.000 230 4、0.010 54、0.003 246、0.010 15、0.000 212 8、0.010 66、0.017 42 mg的混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取冬虫夏草1、北虫草1、百令胶囊[批号20120201(0.5 g/粒)]各0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入0.5%磷酸溶液50 ml,密塞,称定质量,超声处理(功率250 w,频率33 khz)30 min,放冷,再称定质量,用0.5%磷酸溶液补足减失的质量,摇匀,静置,取上清液,12 000 r/min离心5 min,用0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.4 空白试验

取0.5%磷酸溶液作为空白溶液,按“2.1”项下色谱条件进样20 μl,记录色谱图。对照品、供试品及空白溶液色谱图见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、3、5、10、20 μl注入液相色谱仪,在“2.1”项色谱条件下测定,记录峰面积积分值。分别以进样量(μg)为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程和相关系数(r),结果见表2。

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  1. 该评论为私密评论

    2018-10-11 上午1:10 [回复]

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  3. 该评论为私密评论

    2018-10-09 下午5:06 [回复]

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  5. 该评论为私密评论

    2018-10-08 上午11:40 [回复]

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