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人工培养蛹虫草核苷类hplc指纹图谱的建立

分类:虫草文献 作者:阳光虫草 评论:3 热度: 256 ℃

阳光虫草

人工培养蛹虫草核苷类hplc指纹图谱的建立

人工培养蛹虫草核苷类hplc指纹图谱的建立

建立了蛹虫草(cordyceps militaris)核苷类高效液相色谱(hplc)指纹图谱的分析方法,采集10批不同产地人工培养蛹虫草hplc图谱,运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版”软件建立人工蛹虫草标准图谱并以该模式为参照,计算10批不同产地蛹虫草之间的相似度。结果表明:方法的稳定性、精密度、重现性符合方法学要求;建立的核苷类hplc指纹图谱共得到10个共有峰,并对确认了虫草素和腺苷峰这两个特征峰,各样品图谱与标准指纹图谱的相似度均在0.9以上。

人工蛹虫草; 高效液相色谱(hplc); 指纹图谱; 核苷

蛹虫草(cordyceps militaris),又名蛹草菌、北虫草北冬虫夏草,与冬虫夏草同属于麦角菌科、虫草属,是一种具有很高药用价值的真菌。研究表明,人工蛹虫草主要药用成分与冬虫夏草相近,是冬虫夏草的优良替代品[1]。核苷类物质为其主要有效成分之一,尤其是腺苷具有明显的药理作用,《中国药典》也主要以腺苷含量作为冬虫夏草的质量控制指标[2]。近年来,蛹虫草的人工栽培技术已成熟,并进入了产业化生产阶段,然而目前市场上人工培育的蛹虫草质量参差不齐,无统一的质量控制标准。因此,建立蛹虫草质量标准以控制其品质具有重要意义。

指纹图谱技术能全面反映中药内在化学成分的种类及数量,目前国际上已普遍认可中药指纹图谱作为中药质量控制的标准 [3]。hplc方法具有灵敏、分离度高、精确、快速的优点,在中药的成分分析中显示出巨大的优势,与传统的质量控制方法相比,hplc指纹图谱更注重特征谱图的整体性,可明确的揭示样品中各化学成分的分布及含量。因此,笔者参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[4] 的要求,收集10批不同产地的人工培养蛹虫草,应用hplc指纹图谱技术,建立了人工培养蛹虫草核苷类hplc标准指纹图谱,为蛹虫草的质量监控提供参考。

1材料与方法

1.1材料

十批不同产地人工蛹虫草来源见表1。

1.2主要仪器与试剂

agilent1200高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器(美国安捷伦公司);agilent zobax eclipse xdbc18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)不锈钢柱;as10200adt超声波清洗器;虫草素和腺苷标准品购自中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯)购自美国fisher公司。

1.3标准品和样品溶液的制备

精密称取虫草素、腺苷标准品各10 mg于50 ml容量瓶中,用20%甲醇定容至刻度,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜滤过,备用。

蛹虫草样品粉碎后过60目筛,精密称取样品粉末0.5 g,加入20%甲醇20 ml,30 ℃、40 khz超声提取1 h,冷却后用20%甲醇定容至50 ml,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜过滤,配成样品溶液,备用。

1.4色谱条件

色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流速1.0 ml/min;检测波长260 nm,进样体积20 μl;柱温30 ℃。流动相a:甲醇,流动相b:超纯水。梯度洗脱程序:0 min(0%a)→5 min(5%a)→15 min(20%a)→25 min(35%a)→30 min(35%a)。

1.5方法学考察

稳定性试验:取5号样品溶液于0、4、8、12、24 h测定,考察方法的稳定性。

精密度试验:取5号样品溶液,连续进样5次,记录色谱图,考察方法的精密度。

重现性试验:取5号样品,1.3中的方法平行制备供试溶液5份,记录5份样品的色谱图,考察方法的重现性。

1.6hplc指纹图谱的构建

按照1.3的方法制备10批不同来源蛹虫草供试液,记录其hplc色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版”软件,将10批蛹虫草样品色谱图以aia格式导入,以5号为参照图谱,设定时间窗宽度为0.1 min,进行谱峰自动匹配。以平均数法作为标准图谱的生成方法。

1.7特征峰定性

取腺苷和虫草素标准品溶液上hplc分析。通过保留时间的比对,确定样品色谱图中腺苷和虫草素这两个特征峰。

1.8指纹图谱评价

以指纹图谱中峰面积最大的峰为参照峰,以参照峰的保留时间和峰面积作为1,分别计算10批样品共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版”软件计算指纹图谱的相似度。

2结果与分析

2.1人工培养蛹虫草样品hplc色谱图分析

按1.3和1.4方法制备及测定样品,样品色谱图(图1)基线平稳,峰形良好,分离度好。对蛹虫草进行120 min的图谱监测,从色谱峰达到基线分离开始计算,共检测到10个信号较强的峰,全部在30 min内出峰,符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[4]的要求,并确定指纹图谱的采集时间为30 min。

2.2方法学考察

在0、4、8、12、24 h测定5号供试品溶液的色谱图,各主要色谱峰相对保留时间rsd小于1.0%,相对峰面积的rsd在0.8%~1.6%。5号供试品溶液连续进样5次,色谱图的各主要色谱峰相对保留时间rsd在0.1%~0.8%,相对峰面积的rsd在0.6%~1.2%。平行制备供试品溶液5份5号样品溶液测定色谱图,其色谱峰相对保留时间rsd在0.2%~0.8%,相对峰面积的rsd在1.2%~2.4%。结果表明该方法的稳定性、精密度、重现性良好。

2.3人工蛹虫草核苷类hplc指纹图谱的建立

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版”软件,将10批蛹虫草样品色谱图以aia格式导入,以s5为参照图谱,设定时间窗宽度为0.1 min,进行谱峰自动匹配,匹配结果得到10个共有峰(图 2),与样品色谱图反映的信息基本一致。提取10批蛹虫草样品的共有模式建立标准指纹图谱,建立的蛹虫草标准指纹图谱见图3。以标准指纹图谱中峰面积最大的峰为参照物峰(7号峰),参照物峰的保留时间和峰面积作为1,将标准指纹图谱转化得到人工蛹虫草数字化指纹图谱(表2)。

3讨论

本文建立的蛹虫草hplc指纹图谱分析方法的稳定性、精密度、重现性良好,符合方法学要求。用建立的方法采集10批不同产地人工虫草hplc图谱,运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版”软件生成蛹虫草标准指纹图谱,得到10个共有峰,各样品图谱与标准指纹图谱的相似度均在0.9以上。说明建立指纹图谱研究对象可信,所得到的指纹图谱可反映蛹虫草的内在指纹特征且适用于蛹虫草质量控制。

邵力平.真菌分类学[m].北京:中国林业出版社,1984:109.

[2] 傅岚,陈作红.虫草属真菌化学成分及药理作用研究进展[j].生命科学研究,2004,8(1):17.

[3] 唐兴刚,李雪,李盛强,等. 中药指纹图谱的研究进展[j]. 中国兽医杂志,2010,46(6):6264.

[4] 国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行).2000.

[5] 沈照鹏. 虫草主要活性成分分析及指纹图谱研究[d]. 青岛:中国海洋大学,2012.

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[10] li j, jiang hy. progression on study of cordycepin. us chin health hyg[j], 2005, 8:2730.

蛹虫草于2009年被批准成为新资源食品,提取成分被用于食药两用,未提取的草体目前仅见于用于食品及保健食品领域,其中的提取成分蛹虫草菌粉被用于药·品领域!
[1]蛹虫草在保健品领域的应用请见方解蛹虫草保健品 栏目中详细介绍目前蛹虫草在保健品领域的应用!
冬·虫·夏·草为藏药材,食用需要谨慎或在医生的指导下服用,目前冬·虫·夏·草仅限用于药·品.
[1]冬·虫·夏·草在药·品领域的应用请见方解冬·虫·夏·草·药·品 栏目中详细介绍目前冬·虫·夏·草在药·品领域的应用!

人工培养蛹虫草核苷类hplc指纹图谱的建立end
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    2018-10-11 上午8:40 [回复]
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    2018-10-09 上午1:47 [回复]
  3. 沙发
    游客:茜茜:

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    2018-10-08 上午6:27 [回复]

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